* МІКРОСКОП Сатиричний журнал. Виходив Ново-Миколаївську (нині Новосибірськ) в 1922 р. (Іст.: «Сиб. сов. енцикл.», т. I, стор.

Мікроскоп Мікроскоп - це оптичний прилад, призначений для отримання збільшених зображень будь-яких об'єктів або деталей структури цих об'єктів, які не видно неозброєним оком. Взагалі мікроскоп є системою, що складається з двох лінз, але

Рентгенівський мікроскоп Рентгенівський мікроскоп – прилад, що досліджує мікроскопічну структуру та будову об'єкта при використанні рентгенівського випромінювання. Рентгенівський мікроскоп має більшу межу дозволу, ніж світловий мікроскоп, тому що

Іонний мікроскоп Іонний мікроскоп – прилад, в якому для отримання зображень використовується пучок іонів, що створюється газорозрядним або термоіонним джерелом. За принципом дії іонний мікроскоп подібний до електронного мікроскопа. Проходячи крізь об'єкт і

Мікроскоп Мікроскоп – оптичний прилад, що дозволяє отримувати зображення об'єктів, не видимих ​​озброєним оком. Застосовується спостереження мікроорганізмів, клітин, кристалів, структур сплавів з точністю до 0,20 мкм. Цей дозвіл мікроскопа – найменший

Хто винайшов мікроскоп? Слово "мікроскоп" має грецьке походження: перша частина означає "маленький", друга - "спостерігач". Звідси "мікроскоп" - спостерігач за чимось дуже маленьким. Це інструмент, що використовується для розгляду крихітних предметів,

Першими пристроями, за допомогою яких стало можливим спостерігати за нанооб'єктами та пересувати їх, стали скануючі зондові мікроскопи - атомно-силовий мікроскоп і скануючий тунельний мікроскоп, що працює за аналогічним принципом. Атомно-силова мікроскопія (АСМ) була розроблена Г. Біннігом і Г. Рорером, яким за ці дослідження у 1986 році було присуджено Нобелівську премію. Створення атомно-силового мікроскопа, здатного відчувати сили тяжіння та відштовхування, що виникають між окремими атомами, дало змогу нарешті «помацати і побачити» нанооб'єкти.

Малюнок 9. Принцип роботи скануючого зондового мікроскопа. Пунктир показаний хід променя лазера. Інші пояснення у тексті.

Основою АСМ (див. рис. 9) служить зонд, зазвичай зроблений з кремнію і являє собою тонку пластинку-консоль (її називають кантилевером, від англійського слова "cantilever" - консоль, балка). На кінці кантилевера (довжина 500 мкм, ширина 50 мкм, товщина 1 мкм) розташований дуже гострий шип (довжина 10 мкм, радіус закруглення від 1 до 10 нм), що закінчується групою з одного або декількох атомів (див. рис. 10).

Малюнок 10. Електронні мікрофото одного і того ж зонда, зроблені з малим (верх) та великим збільшенням.

При переміщенні мікрозонда вздовж поверхні зразка вістря шипа піднімається і опускається, окреслюючи мікрорельєф поверхні, подібно до того, як ковзає па грамплатівці патефонна голка. На виступаючому кінці кантилевера (над шипом, див. рис. 9) розташована дзеркальна площадка, яку падає і від якої відбивається промінь лазера. Коли шип опускається і піднімається на нерівностях поверхні, відбитий промінь відхиляється, і це відхилення реєструється фотодетектором, а сила, з якою шип притягується до прилеглих атомів - п'єзодатчиком.

Дані фотодетектора та п'єзодатчика використовуються в системі зворотнього зв'язкуяка може забезпечувати, наприклад, постійну величину силу взаємодії між мікрозондом і поверхнею зразка. В результаті можна будувати об'ємний рельєф поверхні зразка в режимі реального часу. Роздільна здатність АСМ методу становить приблизно 0,1-1 нм по горизонталі та 0,01 нм по вертикалі. Зображення бактерії кишкової палички, отримане за допомогою зондувального мікроскопа, що сканує, показано на рис. 11.

Малюнок 11. Бактерія кишкової палички ( Escherichia coli). Зображення одержано за допомогою скануючого зондового мікроскопа. Довжина бактерії – 1,9 мкм, ширина – 1 мкм. Товщина джгутиків та вій – 30 нм та 20 нм, відповідно.

Інша група зондувальних мікроскопів, що сканують, для побудови рельєфу поверхні використовує так званий квантово-механічний «тунельний ефект». Суть тунельного ефекту полягає в тому, що електричний струм між гострою металевою голкою та поверхнею, розташованою на відстані близько 1 нм, починає залежати від цієї відстані – чим менша відстань, тим більше струм. Якщо між голкою і поверхнею прикладати напругу 10 В, цей «тунельний» струм може становити від 10 рА до 10 нА. Вимірюючи цей струм і підтримуючи його постійним, можна зберігати постійним та відстань між голкою та поверхнею. Це дозволяє будувати об'ємний профіль поверхні (див. мал. 12). На відміну від атомно-силового мікроскопа, тунельний мікроскоп, що сканує, може вивчати тільки поверхні металів або напівпровідників.

Малюнок 12. Голка тунельного мікроскопа, що сканує, що знаходиться на постійній відстані (див. стрілки) над шарами атомів досліджуваної поверхні.

Скануючий тунельний мікроскоп можна використовувати і для переміщення якогось атома в точку, вибрану оператором. Наприклад, якщо напруга між голкою мікроскопа і поверхнею зразка зробити трохи більше, ніж треба вивчення цієї поверхні, то найближчий до неї атом зразка перетворюється на іон і " перескакує " на голку. Після цього злегка перемістивши голку і змінивши напругу, можна змусити атом "зістрибнути" назад на поверхню зразка. Отже, можна маніпулювати атомами і створювати наноструктури, тобто. структури поверхні, мають розміри порядку нанометра. Ще в 1990 році співробітники IBM показали, що це можливо, склавши з 35 атомів ксенону назву своєї компанії на платівці з нікелю (рис. 13).

Рисунок 13. Складена з 35 атомів ксенону на платівці з нікелю назва компанії IBM, зроблена співробітниками цієї компанії за допомогою скануючого зондового мікроскопа в 1990 році.

З допомогою зондового мікроскопа можна як рухати атоми, а й створювати передумови їх самоорганізації. Наприклад, якщо на металевій пластині знаходиться крапля води, що містить іони тіолів, то зонд мікроскопа сприятиме такій орієнтації цих молекул, при якій їх два вуглеводневі хвости будуть звернені від пластини. В результаті можна побудувати моношар тіольних молекул, що прилипли до металевої пластини (див. рис. 14). Цей спосіб створення моношару молекул на поверхні металу називають «пір'яною нанолітографією».

Рисунок 14. Зліва вгорі – кантилевер (сіро-сталевий) скануючого зондового мікроскопа над металевою пластинкою. Справа – збільшене зображення області (обведена білим малюнку ліворуч) під зондом кантилевера, де схематично показані молекули тіола з фіолетовими вуглеводневими хвостами, выстраивающимися в моношар біля кінчика зонда. Взято з Scientific American, 2001, Sept, p. 44.

Вступ

В даний час бурхливо розвивається науково-технічний напрямок - нанотехнологія, що охоплює широке коло як фундаментальних, так і прикладних досліджень. Це принципово нова технологія, здатна вирішувати проблеми у таких різних галузях, як зв'язок, біотехнологія, мікроелектроніка та енергетика. Сьогодні більше сотні молодих компаній розробляють нанотехнологічні продукти, які вийдуть на ринок у найближчі два – три роки.

Нанотехнології стануть провідними, в 21 столітті, технологіями і сприятимуть розвитку економіки та соціальної сфери суспільства, вони можуть стати передумовою нової промислової революції. У попередні двісті років прогрес у промисловій революції було досягнуто ціною витрат близько 80% ресурсів Землі. Нанотехнології дозволять значно зменшити обсяг споживання ресурсів і не вплинуть на навколишнє середовище, вони будуть відігравати провідну роль у житті людства, як, наприклад, комп'ютер став невід'ємною частиною життя людей.

Прогрес у нанотехнології стимулювався розвитком експериментальних методів досліджень, найбільш інформативними з яких є методи скануючої зондової мікроскопії, винаходом і особливо поширенням яких світ завдячує нобелівським лауреатам 1986 - професору Генріху Рореру і доктору Герду Біннігу.

Світ був зачарований відкриттям таких простих методів візуалізації атомів, та ще й з можливістю маніпуляції ними. Багато дослідницьких груп почали конструювати саморобні прилади та експериментувати в даному напрямку. В результаті було народжено низку зручних схем приладів, були запропоновані різні методивізуалізації результатів взаємодії зонд-поверхня, такі як: мікроскопія латеральних сил, магнітно-силова мікроскопія, мікроскопія реєстрації магнітних, електростатичних, електромагнітних взаємодій. Набули інтенсивного розвитку методи близькопольної оптичної мікроскопії. Було розроблено методи спрямованого, контрольованого впливу в системі зонд-поверхня, наприклад, нанолітографія – зміни відбуваються на поверхні під дією електричних, магнітних впливів, пластичних деформацій, світла в системі зонд-поверхня. Були створені технології виробництва зондів із заданими геометричними параметрами, зі спеціальними покриттями та структурами для візуалізації різних властивостей поверхонь.

Сканувальна зондова мікроскопія (СЗМ) – один із потужних сучасних методівдослідження морфології та локальних властивостей поверхні твердого тіла з високою просторовою роздільною здатністю. За останні 10 років скануюча зондова мікроскопія перетворилася з екзотичної методики, доступної лише обмеженому числу дослідницьких груп, широко поширений і успішно застосовується інструмент для дослідження властивостей поверхні. В даний час практично жодне дослідження в галузі фізики поверхні та тонкоплівкових технологій не обходиться без застосування методів СЗМ. Розвиток скануючої зондової мікроскопії послужило також основою розвитку нових методів у нанотехнології – технології створення структур з нанометровими масштабами .

1. Історична довідка

Для спостереження дрібних об'єктів голландець Антоні ван Левенгук у 17 столітті винайшов мікроскоп, відкривши світ мікробів. Його мікроскопи були недосконалими і давали збільшення від 150 до 300 разів. Але його послідовники вдосконалили цей оптичний прилад, заклавши фундамент для багатьох відкриттів у біології, геології, фізиці. Однак наприкінці 19 століття (1872 р.) німецький оптик Ернст Карл Аббе показав, що через дифракцію світла роздільна здатність мікроскопа (тобто мінімальна відстань між об'єктами, коли вони ще не зливаються в одне зображення) обмежена довжиною світлової хвилі (0.4 – 0,8 мкм). Тим самим він заощадив масу зусиль оптиків, які намагалися зробити більш досконалі мікроскопи, але розчарував біологів і геологів, які втратили надію отримати прилад зі збільшенням вище 1500x.

Історія створення електронного мікроскопа – чудовий приклад того, як галузі науки і техніки, що самостійно розвиваються, можуть, обмінюючись отриманою інформацією та поєднуючи зусилля, створювати новий потужний інструмент наукових досліджень. Вершиною класичної фізики була теорія електромагнітного поля, яка пояснила поширення світла, виникнення електричних та магнітних полів, рух заряджених частинок у цих полях як поширення електромагнітних хвиль. Хвильова оптика зробила зрозумілими явище дифракції, механізм формування зображення та гру факторів, що визначають дозвіл у світловому мікроскопі. Успіхам у галузі теоретичної та експериментальної фізики ми зобов'язані відкриттям електрона з його специфічними властивостями. Ці окремі і, здавалося б, незалежні шляхи розвитку призвели до створення основ електронної оптики, однією з найважливіших програм якої був винахід ЕМ у 1930-х роках. Прямим натяком на таку можливість можна вважати гіпотезу про хвильову природу електрона, висунуту в 1924 році Луї де Бройлем і експериментально підтверджену в 1927 К.Девіссоном і Л.Джермером у США та Дж.Томсоном в Англії. Тим самим було підказано аналогію, що дозволила побудувати ЕМ за законами хвильової оптики. Х.Буш виявив, що за допомогою електричних та магнітних полів можна формувати електронні зображення. У перші два десятиліття 20 ст. були створені та необхідні технічні передумови. Промислові лабораторії, що працювали над електронно-променевим осцилографом, дали вакуумну техніку, стабільні джерела високої напруги та струму, хороші електронні емітери.

У 1931 Р.Руденберг подав патентну заявку на електронний мікроскоп, що просвічує, а в 1932 М.Кнолль і Е.Руска побудували перший такий мікроскоп, застосувавши магнітні лінзи для фокусування електронів. Цей прилад був попередником сучасного оптичного електронного мікроскопа (ОПЕМ). (Руска був винагороджений за працю тим, що став лауреатом Нобелівської премії з фізики за 1986.) У 1938 Руска і Б. фон Борріс побудували прототип промислового ОПЕМ для фірми «Сіменс-Хальське» в Німеччині; цей прилад дозволив досягти дозволу 100 нм. Декількома роками пізніше А.Пребус і Дж.Хіллер побудували перший ОПЕМ високого дозволу в Торонтському університеті (Канада).

Широкі можливості ОПЕМ майже відразу стали очевидні. Його промислове виробництво було розпочато одночасно фірмою «Сіменс-Хальське» у Німеччині та корпорацією RCA у США. Наприкінці 1940-х років такі прилади почали випускати й інші компанії.

РЕМ у його нинішній формі був винайдений у 1952 році Чарльзом Отлі. Щоправда, попередні варіанти такого пристрою були побудовані Кноллем у Німеччині у 1930-х роках та Зворикіним із співробітниками в корпорації RCA у 1940-х роках, але лише прилад Отлі зміг послужити основою для низки технічних удосконалень, що завершилися впровадженням у виробництво промислового варіанту РЕМ у середині 1960-х років. Коло споживачів такого досить простого у користуванні приладу з об'ємним зображенням та електронним вихідним сигналом розширилося зі швидкістю вибуху. В даний час налічується добрий десяток промислових виробників РЕМ"ів на трьох континентах і десятки тисяч таких приладів, що використовуються в лабораторіях всього світу. , де в 1970 був введений в дію прилад з прискорювальною напругою, рівним 3,5 млн. вольт.РТМ був винайдений Г.Біннігом і Р.Рорером в 1979 в Цюріху. зі створення РТМ Бінніг та Рорер (одночасно з Руською) отримали Нобелівську премію.

У 1986 році Рорером і Біннігом був винайдений зондовий мікроскоп, що сканує. З моменту свого винаходу СТМ широко використовується вченими різних спеціальностей, що охоплюють практично всі природничі дисципліни починаючи від фундаментальних досліджень в галузі фізики, хімії, біології і до конкретних технологічних додатків. Принцип дії СТМ настільки простий, а потенційні можливості такі великі, що неможливо передбачити його вплив на науку та техніку навіть найближчого майбутнього.

Як виявилося надалі, практично будь-які взаємодії гострого зонда з поверхнею (механічні, магнітні) можуть бути перетворені за допомогою відповідних приладів та комп'ютерних програму зображення поверхні.

Установка скануючого зондового мікроскопа складається з кількох функціональних блоків, зображених на рис. 1. Це, по-перше, сам мікроскоп з п'єзоманіпулятором для керування зондом, перетворювачем тунельного струму в напругу та кроковим двигуном для підведення зразка; блок аналого-цифрових та цифро-аналогових перетворювачів та високовольтних підсилювачів; блок керування кроковим двигуном; плата з сигнальним процесором, що розраховує сигнал зворотного зв'язку; комп'ютер, що збирає інформацію та забезпечує інтерфейс з користувачем. Конструктивно блок ЦАПів та АЦП встановлений в одному корпусі з блоком керування кроковим двигуном. Плата із сигнальним процесором (DSP – Digital Signal Processor) ADSP 2171 фірми Analog Devices встановлена ​​в ISA слот розширення персонального комп'ютера.

Загальний вигляд механічної системи мікроскопа подано на рис. 2. У механічну систему входить основа з п'єзоманіпулятором і системою плавної подачі зразка на кроковому двигуні з редуктором і дві вимірювальні вимірювальні головки для роботи в режимах скануючої тунельної і атомно-силової мікроскопії. Мікроскоп дозволяє отримати стійкий атомний дозвіл на традиційних тестових поверхнях без застосування додаткових сейсмічних та акустичних фільтрів.

2. Принципи роботи скануючих зондових мікроскопів

У скануючих зондових мікроскопах дослідження мікрорельєфу поверхні та її локальних властивостей проводиться за допомогою спеціальним чином підготовлених зондів у вигляді голок. Робоча частина таких зондів (вістря) має розміри близько десяти нанометрів. Характерна відстань між зондом та поверхнею зразків у зондових мікроскопах по порядку величин становить 0,1 – 10 нм. В основі роботи зондових мікроскопів лежать різні типивзаємодії зонда із поверхнею. Так, робота тунельного мікроскопа заснована на явищі перебігу тунельного струму між металевою голкою і зразком, що проводить; Різні типи силової взаємодії лежать в основі роботи атомно-силового, магнітно-силового та електросилового мікроскопів. Розглянемо загальні риси, властиві різним зондовим мікроскопам. Нехай взаємодія зонда з поверхнею характеризується деяким параметром Р. Якщо існує досить різка і однозначна залежність параметра Р від відстані зонд-зразок, то даний параметр може бути використаний для організації системи зворотного зв'язку (ОС), що контролює відстань між зондом і зразком. На рис. 3 схематично показаний загальний принципорганізації зворотного зв'язку СЗМ.

Система зворотного зв'язку підтримує значення параметра Р постійним, рівним величині, що задається оператором. Якщо відстань зонд-поверхня змінюється, відбувається зміна параметра Р. У системі ОС формується різницевий сигнал, пропорційний величині ΔР = Р - Р, який посилюється до потрібної величини і подається на виконавчий елемент ИЭ. Виконавчий елемент відпрацьовує даний різницевий сигнал, наближаючи зонд до поверхні або відсуваючи його доти, поки сигнал не стане рівним нулю. у такий спосіб можна підтримувати відстань зонд – зразок з великою точністю. При переміщенні зонда вздовж поверхні зразка відбувається зміна параметра взаємодії Р обумовлена ​​рельєфом поверхні. Система ОС відпрацьовує ці зміни, тому при переміщенні зонда в площині Х, Y сигнал на виконавчому елементі виявляється пропорційним рельєфу поверхні. Для отримання СЗМ зображення здійснюють спеціальним чином організований процес сканування зразка. При скануванні зонд спочатку рухається над зразком вздовж певної лінії (рядкова розгортка), причому величина сигналу на виконавчому елементі, пропорційна рельєфу поверхні, записується в пам'ять комп'ютера. Потім зонд повертається у вихідну точку і переходить на наступний рядок сканування (кадрова розгортка) і процес повторюється знову. Записаний таким чином при скануванні сигнал зворотного зв'язку обробляється комп'ютером, а потім ЗЗМ зображення будується за допомогою засобів рельєфу поверхні комп'ютерної графіки. Поряд із дослідженням рельєфу поверхні, зондові мікроскопи дозволяють вивчати різні властивості поверхні: механічні, електричні, магнітні, оптичні та інші.

3. Скануючі елементи (сканери) зондових мікроскопів

3.1 Скануючі елементи

Для роботи зондових мікроскопів необхідно контролювати робочу відстань зонд-зразок та здійснювати переміщення зонда в площині зразка з високою точністю (на рівні часток ангстрему). Це завдання вирішується за допомогою спеціальних маніпуляторів - скануючих елементів (сканерів). Скануючі елементи зондових мікроскопів виготовляються з п'єзоелектриків – матеріалів, що мають п'єзоелектричні властивості. П'єзоелектрики змінюють свої розміри у зовнішньому електричному полі. Рівняння зворотного п'єзоефекту для кристалів записується у вигляді:

де u – тензор деформації, E – компоненти електричного поля, d – компоненти тензора п'єзоелектричних коефіцієнтів. Вид тензора п'єзоелектричних коефіцієнтів визначається типом симетрії кристалів.

У різних технічних додатках широкого поширення набули перетворювачі з п'єзокерамічних матеріалів. П'єзокераміка є поляризованим полікристалічний матеріал, одержуваний методами спікання порошків з кристалічних сегнетоелектриків. Поляризація кераміки проводиться в такий спосіб. Кераміку нагрівають вище за температуру Кюрі (для більшості п'єзокерамік ця температура менше 300С), а потім повільно охолоджують у сильному (порядку 3 кВ/см) електричному полі. Після остигання п'єзокераміка має наведену поляризацію та набуває здатності змінювати свої розміри (збільшувати або зменшувати залежно від взаємного напрямку вектора поляризації та вектора зовнішнього електричного поля).

У скануючій зондовій мікроскопії широкого поширення набули трубчасті п'єзоелементи (рис. 4). Вони дозволяють отримувати досить великі переміщення об'єктів при відносно невеликих напругах, що управляють. Трубчасті п'єзоелементи є порожнистими тонкостінними циліндрами, виготовленими з п'єзокерамічних матеріалів. Зазвичай електроди у вигляді тонких шарів металу наносяться на зовнішню та внутрішню поверхні трубки, а торці трубки залишаються непокритими.

Під дією різниці потенціалів між внутрішнім та зовнішнім електродами трубка змінює свої поздовжні розміри. У цьому випадку поздовжня деформація під дією електричного радіального поля може бути записана у вигляді:

де l - Довжина трубки в недеформованому стані. Абсолютне подовження п'єзрубки одно

де h – товщина стінки п'єзрубки, V – різниця потенціалів між внутрішнім та зовнішнім електродами. Таким чином, при тому самому напрузі V подовження трубки буде тим більше, чим більше її довжина і чим менше товщина її стінки .

З'єднання трьох трубок в один вузол дозволяє організувати прецизійні переміщення зонда мікроскопа у трьох взаємно перпендикулярних напрямках. Такий скануючий елемент називається тріподом.

Недоліками такого сканера є складність виготовлення та сильна асиметрія конструкції. На сьогоднішній день у скануючій зондовій мікроскопії найбільш широко використовуються сканери, виготовлені на основі одного трубчастого елемента. Загальний вигляд трубчастого сканера та схема розташування електродів представлені на рис. 5. Матеріал трубки має радіальний напрямок вектора поляризації.

Внутрішній електрод зазвичай суцільний. Зовнішній електрод сканера розділений утворюючим циліндром на чотири секції. При подачі протифазної напруги на протилежні секції зовнішнього електрода (щодо внутрішнього) відбувається скорочення ділянки трубки в тому місці, де напрямок поля збігається з напрямком поляризації, і подовження там, де вони спрямовані в протилежні сторони. Це призводить до вигину трубки у відповідному напрямку. Таким чином, здійснюється сканування в площині Х, Y. Зміна потенціалу внутрішнього електрода щодо всіх зовнішніх секцій призводить до подовження або скорочення трубки по осі Z. Таким чином, можна організувати трикоординатний сканер на базі однієї п'єзотрубки. Реальні скануючі елементи мають часто складнішу конструкцію, проте принципи їх роботи залишаються тими самими.

Широкого поширення набули також сканери на основі біморфних п'єзоелементів. Біморф є дві пластини п'єзоелектрика, склеєні між собою таким чином, що вектори поляризації в кожній з них направлені в протилежні сторони (рис. 6). Якщо подати напругу на біморфні електроди, як показано на рис. 6 то одна з пластин буде розширюватися, а інша стискатися, що призведе до вигину всього елемента. У реальних конструкціях біморфних елементів створюється різниця потенціалів між внутрішнім загальним та зовнішніми електродами так, щоб в одному елементі поле збігалося з напрямком вектора поляризації, а в іншому було спрямоване протилежно.

Вигин біморфа під впливом електричних полів покладено основою роботи біморфних пьезосканеров. Поєднуючи три біморфні елементи в одній конструкції, можна реалізувати трипод на біморфних елементах.

Якщо зовнішні електроди біморфного елемента розділити чотирма сектора, можна організувати рух зонда по осі Z й у площині X, Y однією біморфному елементі (рис. 7).

Дійсно, подаючи протифазну напругу на протилежні пари секцій зовнішніх електродів, можна вигинати біморф так, сто зонд рухатиметься в площині X, Y (рис. 7 (а, б)). А змінюючи потенціал внутрішнього електрода щодо всіх секцій зовнішніх електродів, можна прогинати біморф, переміщуючи зонд у напрямку Z (рис. 7(в, г)).

3.2 Нелінійність п'єзокераміки

Незважаючи на ряд технологічних переваг перед кристалами, п'єзокераміки мають деякі недоліки, що негативно впливають на роботу скануючих елементів. Одним із таких недоліків є нелінійність п'єзоелектричних властивостей. На рис. 8 як приклад наведена залежність величини зміщення п'єзрубки в напрямку Z від величини прикладеного поля. У загальному випадку (особливо при великих керуючих полях) п'єзокераміки характеризуються нелінійною залежністю деформацій від поля (або від напруги, що управляє).

Таким чином, деформація п'єзокераміки є складною функцією зовнішнього електричного поля:

Для малих керуючих полів дана залежність може бути представлена ​​в такому вигляді:

u = d* E+ α* E*Е+…

де d і α - лінійні та квадратичні модулі п'єзоелектричного ефекту.

Типові значення полів Е, за яких починають позначатися нелінійні ефекти, становлять близько 100 В/мм. Тому для коректної роботи елементів, що сканують, зазвичай використовуються керуючі поля в області лінійності кераміки (Е< Е) .

електронний мікроскоп скануючий зондовий

3.3 Кріп п'єзокераміки та гістерезис п'єзокераміки

Іншим недоліком п'єзокераміки є так званий крип (creep – повзучість) – запізнення реакції зміну величини управляючого електричного поля.

Крип призводить до того, що в СЗМ зображення спостерігаються геометричні спотворення, пов'язані з цим ефектом. Особливо сильно крип позначається під час виведення сканерів у задану точку щодо локальних вимірів і початкових етапах процесу сканування. Для зменшення впливу крипа кераміки застосовуються тимчасові затримки у зазначених процесах, що дозволяють частково компенсувати запізнення сканера.

Ще одним недоліком п'єзокераміки є неоднозначність залежності подовження від напрямку зміни електричного поля (гістерезис).

Це призводить до того, що при тих самих керуючих напругах п'єзокераміка виявляється в різних точках траєкторії в залежності від напрямку руху. Для виключень спотворень СЗМ зображень, обумовлених гістерезисом п'єзокераміки, реєстрацію інформації при скануванні зразків виробляють лише на одній із гілок залежності.

4. Пристрої для прецизійних переміщень зонда та зразка

4.1 Механічні редуктори

Однією з важливих технічних проблему скануючій зондовій мікроскопії є необхідність прецизійного переміщення зонда та зразка з метою утворення робочого проміжку мікроскопа та вибору досліджуваної ділянки поверхні. Для вирішення цієї проблеми застосовуються різні типи пристроїв, які здійснюють переміщення об'єктів із високою точністю. Широке поширення набули різні механічні редуктори, в яких грубому переміщенню вихідного рушія відповідає тонке переміщення об'єкта, що зміщується. Способи редукції переміщень можуть бути різними. Широко застосовуються важільні устрою, у яких редукція величини переміщення здійснюється з допомогою різниці довжини плечей важелів. Схема важельного редуктора наведено на рис. 9.

Механічний важіль дозволяє отримувати редукцію переміщення з коефіцієнтом

Таким чином, що більше відношення плеча L до плеча l, то більш точно можна контролювати процес зближення зонда та зразка.

Також у конструкціях мікроскопів широко використовуються механічні редуктори, у яких редукція переміщень досягається за рахунок різниці коефіцієнтів жорсткості двох послідовно з'єднаних пружних елементів (рис. 10). Конструкція складається з жорсткої основи, пружини та пружної балки. Жорсткості пружини k та пружної балки До підбирають таким чином, щоб виконувалася умова: k< K .

Коефіцієнт редукції дорівнює відношенню коефіцієнтів жорсткості пружних елементів:

Таким чином, що більше ставлення жорсткості балки до жорсткості пружини, то точніше можна контролювати зміщення робочого елемента мікроскопа.

4.2 Крокові електродвигуни

Крокові електродвигуни (ШЕД) є електромеханічними пристроями, які перетворюють електричні імпульси в дискретні механічні переміщення. Важливою перевагою крокових електродвигунів є те, що вони забезпечують однозначну залежність положення ротора від вхідних імпульсів струму, тому кут повороту ротора визначається числом імпульсів, що управляють. У ШЕД момент, що обертає, створюється магнітними потоками, створюваними полюсами статора і ротора, які відповідним чином орієнтовані один щодо одного.

Найбільш просту конструкцію мають двигуни із постійними магнітами. Вони складаються зі статора, який має обмотки, та ротора, що містить постійні магніти. На рис. 11 представлена ​​спрощена конструкція крокового електродвигуна.

Полюси ротора, що чергуються, мають прямолінійну форму і розташовані паралельно осі двигуна. Показаний на малюнку двигун має 3 пари полюсів ротора та 2 пари полюсів статора. Двигун має 2 незалежні обмотки, кожна з яких намотана на два протилежні полюси статора. показаний двигун має величину кроку 30 град. При включенні струму однієї з обмоток ротор прагне зайняти таке становище, у якому різноіменні полюси ротора і статора перебувають одне навпроти друга. Для безперервного обертання потрібно включати обмотки поперемінно.

На практиці застосовуються крокові електродвигуни, що мають складнішу конструкцію та забезпечують від 100 до 400 кроків на один оборот ротора. Якщо такий двигун працює в парі з різьбовим з'єднанням, то при кроці різьблення 0,1 мм забезпечується точність позиціонування об'єкта порядку 0,25 - 1 мкм. Для збільшення точності використовуються додаткові механічні редуктори. Можливість електричного управління дозволяє ефективно використовувати ШЕД автоматизованих системахзближення зонда та зразка скануючих зондових мікроскопів.

4.3 Крокові п'єзодвигуни

Вимоги хорошої ізоляції приладів від зовнішніх вібрацій та необхідність роботи зондових мікроскопів в умовах вакууму накладають серйозні обмеження на застосування суто механічних пристроїв для переміщень зонда та зразка. У зв'язку з цим широке поширення в зондових мікроскопах набули пристрої на основі п'єзоелектричних перетворювачів, що дозволяють здійснювати дистанційне керуванняпереміщення об'єктів.

Одна з конструкцій крокового інерційного п'єзодвигуна наведена на рис. 12. Цей пристріймістить основу (1), на якій закріплена п'єзоелектрична трубка (2). Трубка має електроди (3) на зовнішній та внутрішній поверхнях. На кінці трубки укріплена розрізна пружина (4), що являє собою циліндр з окремими пелюстками. У пружині встановлено тримач об'єкта (5) – досить потужний циліндр з полірованою поверхнею. Об'єкт, що переміщається, може кріпитися до утримувача за допомогою пружини або накидної гайки, що дозволяє пристрою працювати при будь-якій орієнтації в просторі.

Пристрій працює наступним чином. Для переміщення тримача об'єкта в напрямку осі Z до електродів п'єзрубки прикладається імпульсна напруга пилкоподібної форми (рис. 13).

На пологому фронті пилкоподібної напруги трубка плавно подовжується або стискається в залежності від полярності напруги, і її кінець разом з пружиною та тримачем об'єкта зміщується на відстань:

У момент скидання пилкоподібної напруги трубка повертається у вихідне положення з прискоренням a, що має спочатку максимальну величину:

де - резонансна частота поздовжніх коливань трубки. При виконанні умови F< ma (m – масса держателя объекта, F - сила трения между держателем объекта и разрезной пружиной), держатель объекта, в силу своей инерционности, проскальзывает относительно разрезной пружины. В результате держатель объекта перемещается на некоторый шаг К Δl относительно вихідного становища. Коефіцієнт визначається співвідношенням мас деталей конструкції і жорсткістю розрізної пружини. При зміні полярності імпульсів напруги, що управляє, відбувається зміна напрямку руху об'єкта. Таким чином, подаючи пилкоподібну напругу різної полярності на електроди п'єзрубки, можна переміщати об'єкт у просторі і проводити зближення зонда і зразка в зондовому сканувальному мікроскопі .

5. Захист зондових мікроскопів від зовнішніх впливів

5.1 Захист від вібрацій

Для захисту приладів від зовнішніх вібрацій застосовують різні типи віброізолюючих систем. Умовно їх можна поділити на пасивні та активні. Основна ідея, закладена у пасивні віброізолюючі системи, полягає в наступному. Амплітуда вимушених коливань механічної системи швидко спадає зі збільшенням різниці між частотою збудливої ​​сили та власною резонансною частотою системи (типова амплітудно-частотна характеристика (АЧХ) коливальної системи наведена на рис. 14).

Тому зовнішні впливи з частотами > практично практично не надає помітного впливу на коливальну систему. Отже, якщо помістити вимірювальну головку зондового мікроскопа на віброізолюючу платформу або пружний підвіс (рис. 15), то на корпус мікроскопа пройдуть лише зовнішні коливання з частотами, близькими до резонансної частоти віброізолюючої системи. Оскільки власні частоти головок СЗМ становлять 10 – 100 кГц, вибираючи резонансну частоту віброізолюючої системи досить низькою (порядку 5 – 10 Гц), можна дуже ефективно захистити прилад від зовнішніх вібрацій. З метою гасіння коливань на власних резонансних частотах у віброізолюючі системи вводять дисипативні елементи з в'язким тертям.

Таким чином, для забезпечення ефективного захисту необхідно, щоб резонансна частота віброізолюючої системи була якнайменше. Проте практично реалізувати дуже низькі частоти важко.

Для захисту головок СЗМ успішно застосовуються активні системипридушення зовнішніх вібрацій. Такі пристрої є електромеханічними системами з негативним зворотним зв'язком, який забезпечує стабільне положення віброізолюючої платформи в просторі (рис. 16) .

5.2 Захист від акустичних шумів

Ще одним джерелом вібрації елементів конструкції зондових мікроскопів є акустичні шуми різної природи.

Особливістю акустичних перешкод є те, що акустичні хвилі безпосередньо впливають на елементи конструкції головок СЗМ, що призводить до коливань зонда щодо досліджуваного поверхні зразка. Для захисту СЗМ від акустичних перешкод застосовуються різні захисні ковпаки, що дозволяють істотно знизити рівень акустичної перешкоди робочого проміжку мікроскопа. Найбільш ефективним захистом від акустичних перешкод є розміщення вимірювальної головки зондового мікроскопа у вакуумній камері (рис. 17).

5.3 Стабілізація термодрейфу положення зонда над поверхнею

Однією з важливих проблем СЗМ є завдання стабілізації зонда над поверхнею досліджуваного зразка. Головним джерелом нестабільності зонда є зміна температури навколишнього середовища або розігрів елементів конструкції зондового мікроскопа під час його роботи. Зміна температури твердого тіла призводить до термопружних деформацій. Такі деформації дуже істотно впливають працювати зондових мікроскопів. Для зменшення термодрейфу застосовують термостатування вимірювальних головок СЗМ або вводять у конструкцію головок термокомпенсуючі елементи. Ідея термокомпенсації полягає у наступному. Будь-яку конструкцію СЗМ можна подати у вигляді набору елементів з різними коефіцієнтами теплового розширення (рис. 18(а)).

Для компенсації термодрейфу в конструкцію вимірювальних головок СЗМ вводять компенсуючі елементи, що мають різні коефіцієнти розширення так, щоб виконувалася умова рівності нулю суми температурних розширень у різних плечах конструкції:

ΔL = ∑ ΔL = ΔT ∑αl0

Найбільш простим способомзменшення термодрейфу положення зонда по осі Z є введення в конструкцію СЗМ компенсуючих елементів з того ж матеріалу і з тими ж характерними розмірами, що основні елементи конструкції (рис. 18 (б)). При зміні температури такої конструкції зсув зонда у напрямку Z буде мінімальним. Для стабілізації положення зонда в площині X, Y вимірювальні головки мікроскопів виготовляються як аксіально-симетричних конструкцій .

6. Формування та обробка СЗМ зображень

6.1 Процес сканування

Процес сканування поверхні в зондовому мікроскопі, що сканує, має схожість з рухом електронного променя по екрану в електроннопроменевій трубці телевізора. Зонд рухається вздовж лінії (рядки) спочатку у прямому, а потім у зворотному напрямку (рядкова розгортка), а потім переходить на наступний рядок (кадрова розгортка) (рис. 19). Рух зонда здійснюється за допомогою сканера невеликими кроками під дією пилкоподібних напруг, що формуються цифро-аналоговими перетворювачами. Реєстрація інформації про рельєф поверхні провадиться, як правило, на прямому проході.

Інформація, отримана за допомогою зондувального скануючого мікроскопа, зберігається у вигляді СЗМ кадру - двовимірного масиву цілих чисел a (матриці). Фізичний зміст цих чисел визначається тією величиною, яка оцифровувалась у процесі сканування. Кожному значенню пари індексів ij відповідає певна точка поверхні у межах поля сканування. Координати точок поверхні обчислюються за допомогою простого множення відповідного індексу величину відстані між точками, в яких проводився запис інформації.

Як правило, СЗМ кадри є квадратними матрицями, що мають розмір 2 (в основному 256х256 і 512х512 елементів). Візуалізація СЗМ кадрів проводиться засобами комп'ютерної графіки, в основному, у вигляді тривимірних (3D) та двовимірних 2D яскравих зображень. При 3D візуалізації зображення поверхні будується в аксонометричній перспективі за допомогою пікселів або ліній. На додаток до цього, використовуються різні способи підсвічування пікселів, що відповідають різній висоті рельєфу поверхні. Найбільш ефективним способомрозмальовки 3D зображень є моделювання умов підсвічування поверхні точковим джерелом, розташованим у певній точці простору над поверхнею (рис. 20). При цьому вдається наголосити на дрібномасштабних нерівностях рельєфу. Також засобами комп'ютерної обробки та графіки реалізуються масштабування та обертання 3D СЗМ зображень. При 2D візуалізації кожної точки поверхні ставиться у відповідність колір. Найбільш широко використовуються градієнтні палітри, у яких розмальовка зображення виробляється тоном певного кольору відповідно до висоти точки поверхні.

Локальні СЗМ вимірювання, зазвичай, пов'язані з реєстрацією залежностей досліджуваних величин від різних параметрів. Наприклад, це залежності величини електричного струмучерез контакт зонд-поверхня від прикладеної напруги, залежності різних параметрів силової взаємодії зонда та поверхні від відстані зонд-зразок та ін. Дана інформаціязберігається у вигляді векторних масивів або у вигляді матриць 2 х N. Для їх візуалізації у програмному забезпеченні мікроскопів передбачається набір стандартних засобівзображення графіків функцій.

6.2 Методи побудови та обробки зображень

При вивченні властивостей об'єктів методами зондової мікроскопії, що сканує, основним результатом наукового пошуку є, як правило, тривимірні зображення поверхні цих об'єктів. Адекватність інтерпретації зображень залежить від кваліфікації спеціаліста. Разом з тим, при обробці та побудові зображень використовується низка традиційних прийомів, про які слід знати під час аналізу зображень. Скануючий зондовий мікроскоп виник момент інтенсивного розвитку комп'ютерної техніки. Тому під час запису тривимірних зображень у ньому були використані цифрові методи зберігання інформації, розроблені для комп'ютерів. Це привело до значної зручності при аналізі та обробці зображень, проте довелося пожертвувати фотографічною якістю, властивою методам електронної мікроскопії. Інформація, отримана з допомогою зондового мікроскопа, в комп'ютері представляється як двомірної матриці цілих чисел. Кожне число в цій матриці, залежно від режиму сканування, може бути значенням тунельного струму, значенням відхилення або значенням більш складної функції. Якщо показати людині цю матрицю, то жодного зв'язкового уявлення про досліджувану поверхню він отримати не зможе. Отже, перша проблема - це перетворити числа на вигляд, зручний для сприйняття. Робиться це так. Числа у вихідній матриці лежать у певному діапазоні, є мінімальне та максимальне значення. Цьому діапазону цілих чисел ставиться у відповідність палітра кольорів. Таким чином, кожне значення матриці відображається у точці певного кольору на прямокутному зображенні. Рядок та стовпець, в яких знаходиться це значення, стають координатами точки. У результаті ми отримуємо картину, де, наприклад, висота поверхні передається кольором – як у географічної карті. Але на карті зазвичай використовуються лише десятки кольорів, а на нашій картині їх сотні та тисячі. Для зручності сприйняття точки, близькі по висоті, повинні передаватись подібними кольорами. Може виявитися, і, як правило, так завжди і буває, що діапазон вихідних значень більший, ніж кількість можливих кольорів. У цьому випадку відбувається втрата інформації, і збільшення кількості кольорів не є виходом зі становища, оскільки можливості людського ока обмежені. Потрібна додаткова обробка інформації, причому залежно від завдань обробка має бути різною. Комусь необхідно побачити всю картину повністю, а хтось хоче розглянути деталі. Для цього використовуються різноманітні методи.

6.3 Віднімання постійного нахилу

Зображення поверхні, отримані з допомогою зондових мікроскопів, зазвичай мають загальний нахил. Це може бути обумовлено кількома причинами. По-перше, нахил може з'являтися внаслідок неточної установки зразка щодо зонда; по-друге, може бути пов'язаний з температурним дрейфом, який призводить до зміщення зонда щодо зразка; по-третє, може бути зумовлений нелінійністю переміщень пьезосканера. На відображення нахилу витрачається великий обсяг корисного простору в СЗМ кадрі, так що не видно дрібні деталі зображення. Для усунення цього недоліку проводять операцію віднімання постійного нахилу. Для цього на першому етапі методом найменших квадратів знаходиться апроксимуюча площина

Р(х,y), що має мінімальні відхилення від рельєфу поверхні Z = f(x,y) потім проводиться віднімання даної площини із ЗЗМ зображення. Віднімання доцільно виконувати у різний спосібзалежно від природи нахилу.

Якщо нахил у СЗМ зображенні обумовлений нахилом зразка щодо зразка зонда, то доцільно провести поворот площини на кут, що відповідає куту між нормаллю до площини та віссю Z; при цьому координати поверхні Z = f(x, y) перетворюються відповідно до перетворення просторового повороту. Однак при даному перетворенніможливе отримання зображення поверхні як багатозначної функції Z = f(x,y). Якщо нахил обумовлений термодрейфом, то процедура віднімання нахилу зводиться до віднімання Z – координат площини Z – координат СЗМ зображення:

В результаті виходить масив з меншим діапазоном значень, і дрібні деталі зображення відображатимуться великою кількістю кольорів, стаючи більш помітними.

6.4 Усунення спотворень, пов'язаних із неідеальністю сканера

Неідеальність властивостей сканера призводить до того, що СЗМ зображення містить низку специфічних спотворень. Частково неідеальності сканера, такі як нерівноправність прямого та зворотного ходу сканера (гістерезис), крип та нелінійність п'єзокераміки компенсуються апаратними засобами та вибором оптимальних режимів сканування. Однак, незважаючи на це, ЗЗМ зображення містять спотворення, які важко усунути на апаратному рівні. Зокрема, оскільки рух сканера в площині зразка впливає положення зонда над поверхнею, СЗМ зображення являють собою суперпозицію реального рельєфу і деякої поверхні другого (а часто і вищого) порядку.

Для усунення спотворення такого роду методом найменших квадратів знаходиться апроксимує поверхня другого порядку Р(x,y), що має мінімальні відхилення від вихідної функції Z = f(x,y), і потім дана поверхня віднімається з вихідного СЗМ зображення:

Ще один тип спотворень пов'язаний з нелінійністю та неортогональністю переміщень сканера у площині X, Y. Це призводить до спотворення геометричних пропорцій у різних частинах СЗМ зображення поверхні. Для усунення таких спотворень виконують процедуру корекції СЗМ зображень за допомогою файлу коефіцієнтів корекції, який створюється при скануванні конкретним сканером тестових структур добре відомим рельєфом .

6.5 Фільтрація СЗМ зображень

Шуми апаратури (в основному, це шуми високочутливих вхідних підсилювачів), нестабільності контакту зонд-зразок при скануванні, зовнішні акустичні шуми та вібрації призводять до того, що СЗМ зображення поряд з корисною інформацією мають шумову складову. Частково шуми СЗМ зображень можуть бути видалені програмними засобами.

6.6 Медіанна фільтрація

Хороші результати при видаленні високочастотних випадкових перешкод у кадрах ЗЗМ дає медіанна фільтрація. Це нелінійний метод обробки зображень, суть якого можна пояснити так. Вибирається робоче вікно фільтра, що складається з nxn точок (для визначеності візьмемо вікно 3 х 3, тобто містить 9 точок (рис. 24)).

У процесі фільтрації вікно переміщається по кадру від точки до точки, і виконується наступна процедура. Значення амплітуди СЗМ зображення в точках даного вікна вибудовуються за зростанням, і значення, яке стоїть у центрі відсортованого ряду, заноситься до центральної точки вікна. Потім вікно зсувається у наступну точку, і процедура сортування повторюється. Таким чином, потужні випадкові викиди і провали при такому сортуванні завжди виявляються на краю масиву, що сортується, і не увійдуть у підсумкове (відфільтроване) зображення. При такій обробці краями кадру залишаються нефільтровані області, які відкидаються в кінцевому зображенні .

6.7 Методи відновлення поверхні за її СЗМ зображення

Одним із недоліків, властивих всім методам скануючої зондової мікроскопії, є кінцевий розмір робочої частини зондів, що використовуються. Це призводить до суттєвого погіршення просторового дозволу мікроскопів та значних спотворень у СЗМ зображення при скануванні поверхонь з нерівностями рельєфу, порівнянними з характерними розмірами робочої частини зонда.

Фактично одержуване СЗМ зображення є «згорткою» зонда і досліджуваної поверхні. Процес «згортки» форми зонда з рельєфом поверхні проілюстровано в одновимірному випадку на рис. 25.

Частково цю проблему дозволяють вирішити розвинені останнім часом методи відновлення СЗМ зображень, що базуються на комп'ютерній обробці СЗМ даних з урахуванням конкретної форми зондів. Найбільш ефективним методом відновлення поверхні є метод чисельної деконволюції, який використовує форму зонда, одержувану експериментально при скануванні тестових (з добре відомим рельєфом поверхні) структур.

Слід зазначити, що повне відновлення поверхні зразка можливе лише за дотримання двох умов: зонд у процесі сканування торкнувся всіх точок поверхні, і в кожний момент зонд торкався лише однієї точки поверхні. Якщо ж зонд у процесі сканування не може досягти деяких ділянок поверхні (наприклад, якщо зразок має ділянки рельєфу, що нависають), то відбувається лише часткове відновлення рельєфу. Причому, чим більшої кількості точок поверхні стосувався зонд при скануванні, тим достовірніше можна реконструювати поверхню.

На практиці СЗМ зображення та експериментально визначена форма зонда є двовимірними масивами дискретних значень, для яких похідна є погано визначеною величиною. Тому замість обчислення похідної дискретних функцій на практиці при чисельній деконволюції СЗМ зображень використовується умова мінімальності відстані між зондом і поверхнею при скануванні з середньою середньою висотою .

У цьому випадку за висоту рельєфу поверхні в даній точці можна прийняти мінімальну відстань між точкою зонда та відповідною точкою поверхні для цього положення зонда щодо поверхні. За своїм фізичним змістом ця умоваеквівалентно умові рівності похідних, проте вона дозволяє проводити пошук точок торкання зонда з поверхнею адекватнішим методом, що істотно скорочує час реконструювання рельєфу.

Для калібрування та визначення форми робочої частини зондів використовуються спеціальні тестові структури з відомими параметрами рельєфу поверхні. Види найпоширеніших тестових структур та його характерні зображення, отримані з допомогою атомно-силового мікроскопа представлені на рис. 26 та рис. 27 .

Калібрувальна решітка у вигляді гострих шипів дозволяє добре прописувати кінчик зонда, тоді як прямокутні грати допомагають відновити форму бічної поверхні. Комбінуючи результати сканування даних решіток, можна повністю відновлювати форму робочої частини зондів.

7. Сучасні СЗМ

1) Скандувальний зондовий мікроскоп SM-300

Призначений для вивчення морфологічних особливостей та структури порового простору. SM-300 (рис. 28) забезпечений вбудованим мікроскопом оптичного позиціонування, який позбавляє необхідності нескінченного пошуку області, що представляє інтерес. Кольорове оптичне зображення вибірки з невеликим збільшенням відображається на комп'ютерному моніторі. Перехрестя на оптичному зображенні відповідає позиції електронного променя. Використовуючи перехрестя, можна зробити швидке позиціонування, щоб задати область, що представляє інтерес для аналізу растровим

Мал. 28. СЗМ SM-300 електронним мікроскопом. Блок оптичного позиціонування оснащений окремим комп'ютером, що забезпечує його апаратну незалежність від мікроскопа, що сканує.

МОЖЛИВОСТІ SM - 300

· Гарантована роздільна здатність 4 нм

· Унікальний оптичний позиціонуючий мікроскоп (додатково)

· Інтуїтивно зрозуміле програмне забезпечення Windows ®

· Повністю комп'ютерне управління растровим мікроскопом та побудовою зображень

· Стандартний телевізійний висновок із обробкою цифрового сигналу

· Комп'ютерне керування системою низького вакууму (опція)

· Всі дослідження, що виконуються на одному положенні осі аплікат (12 мм)

· Елементний рентгенівський мікроаналіз у режимах низького та високого вакууму (додатково)

· Можливість роботи в умовах нормального кімнатного освітлення

· Дослідження непровідних зразків без їх попередньої підготовки

· Роздільна здатність 5.5 нм у режимі низького вакууму

· Програмне управління перемиканням режимів

· Вибирається діапазон вакууму камери 1.3 - 260 Па

· Виведення зображення на екран комп'ютерного монітора

· Послідовний V-назад розсіяний датчик Робінсона

2) Скануючий зондовий мікроскоп високої роздільної здатності Supra50VP із системою мікроаналізу INCA Energy+Oxford.

Прилад (рис. 29) призначений для проведення досліджень у всіх галузях матеріалознавства, в галузі нано- та біотехнологій. Прилад дозволяє працювати із зразками великого розміру, крім того, він підтримує режим роботи в умовах змінного тиску для дослідження непровідних зразків без підготовки. Мал. 29. СЗМ Supra50VP

ПАРАМЕТРИ:

Прискорювальна напруга 100 В – 30 кВ (катод із польовою емісією)

Макс. збільшення до х 900000

Надвисока роздільна здатність – до 1 нм (при 20 кВ)

Вакуумний режим зі змінним тиском від 2 до 133 Па

Прискорювальна напруга – від 0.1 до 30 кВ

Моторизований столик із п'ятьма ступенями свободи

Роздільна здатність EDX детектора 129 еВ на лінії Ka(Mn), швидкість рахунку до 100000 імп/с

3) LEO SUPRA 25 модернізований мікроскоп з «GEMINI» колоною та з польовою емісією (рис.30).

– Розроблено для досліджень у галузі наноаналізу

– Можна підключати як EDX, так і WDX системи для мікроаналізу

- Роздільна здатність 1.5 нм на 20 кВ, 2 нм на 1 кВ.

Висновок

За минулі роки застосування зондової мікроскопії дозволило досягти унікальних наукових результатів у різних галузях фізики, хімії та біології.

Якщо перші скануючі зондові мікроскопи були приладами-індикаторами для якісних досліджень, то сучасний зондовий мікроскоп, що сканує, - це прилад, що інтегрує в собі до 50 різних методик дослідження. Він здатний здійснювати задані переміщення в системі зонд-зразок з точністю до 0,1%, розраховувати форм-фактор зонда, проводити прецизійні виміри досить великих розмірів (до 200 мкм у площині сканування та 15 – 20 мкм за висотою) і, при цьому, забезпечувати субмолекулярний дозвіл.

Скануючі зондові мікроскопи перетворилися на один із найбільш затребуваних на світовому ринку класів приладів для наукових досліджень. Постійно створюються нові конструкції приладів, спеціалізовані до різних додатків.

Динамічний розвиток нанотехнології потребує дедалі більшого розширення можливостей дослідницької техніки. Високотехнологічні компанії у всьому світі працюють над створенням дослідницьких і технологічних нанокомплексів, що поєднують у собі цілі групи аналітичних методів, таких як: спектроскопія комбінаційного розсіювання світла, люмінесцентна спектроскопія, рентгенівська спектроскопія для елементного аналізу, методи оптичної мікро пучків. Системи набувають потужних інтелектуальних можливостей: здатність розпізнавати і класифікувати зображення, виділяти необхідні контрасти, наділяються можливостями з моделювання результатів, а обчислювальні потужності забезпечуються використанням суперкомп'ютерів.

Техніка, що розробляється, має могутні можливості, але кінцевою метою її використання є отримання наукових результатів. Опанування можливостей цієї техніки саме по собі є завданням високого ступеня складності, що вимагає підготовки висококласних фахівців, здатних ефективно користуватися цими приладами та системами.

Список літератури

1. Неволін В. К. Основи тунельно-зондової технології / В. К. Неволін, - М.: Наука, 1996, - 91 с.

2. Кулаков Ю. А. Електронна мікроскопія / Ю. А. Кулаков, - М.: Знання, 1981, - 64 с.

3. Володін А.П. Скануюча мікроскопія / А. П. Володін, - М.: Наука, 1998, - 114 с.

4. Сканувальна зондова мікроскопія біополімерів / За редакцією І. В. Ямінського, - М.: Науковий світ, 1997, - 86 с.

5. Миронов У. Основи скануючої зондової мікроскопії / У. Миронов, – М.: Техносфера, 2004, – 143 з.

6. Риков С. А. Сканувальна зондова мікроскопія напівпровідникових матеріалів / С. А. Риков, - СПБ: Наука, 2001, - 53 с.

7. Биков В. А., Лазарєв М. І. Сканувальна зондова мікроскопія для науки і промисловості / В. А. Биков, М. І. Лазарєв // Електроніка: наука, технологія, бізнес, – 1997, – №5, – с. 7 – 14.

7. Застосування скануючого зондового мікроскопа на дослідження біологічних об'єктів

7. Застосування скануючого зондового мікроскопа для дослідження біологічних об'єктів.

7.1. Цілі роботи 2

7.2. Інформація для викладача 3

7.4. Методичні вказівки 31

7.5. Техніка безпеки 32

7.6. Завдання 32

7.7. Контрольні питання 32

7.8. Література 32

Лабораторну роботу було розроблено Нижегородським Державним Університетом ім. Н.І. Лобачевського

7.1.Цілі роботи

Дослідження морфологічних параметрів біологічних структур є важливим завданням для біологів, оскільки розміри та форма деяких структур багато в чому визначають їх фізіологічні властивості. Порівнюючи морфологічні дані з функціональними характеристиками, можна отримати повноцінну інформацію про участь живих клітин у підтримці фізіологічного балансу організму людини або тварини.

Раніше біологи та медики мали змогу вивчати свої препарати лише на оптичному та електронному мікроскопах. Ці дослідження давали якусь картину морфології клітин, зафіксованих, забарвлених і тонкими металевими покриттями, отриманими шляхом напилення. Дослідити морфологію живих об'єктів, її зміни під впливом різних чинників було неможливо, але було дуже привабливим.

Сканувальна зондова мікроскопія (СЗМ) відкрила нові можливості у дослідженні клітин, бактерій, біологічних молекул, ДНК в умовах максимально наближених до нативних. СЗМ дозволяє досліджувати біологічні об'єкти без спеціальних фіксаторів та барвників, на повітрі, або навіть у рідкому середовищі.

В даний час СЗМ використовується у великому різноманітті дисциплін як у фундаментальних наукових дослідженнях, так і в прикладних високотехнологічних розробках. Багато науково-дослідних інститутів країни оснащуються апаратурою зондової мікроскопії. У зв'язку з цим постійно зростає попит на висококласних спеціалістів. Для задоволення фірмою НТ-МДТ (м. Зеленоград, Росія) розроблено спеціалізовану навчально-наукову лабораторію скануючої зондової мікроскопії. NanoEducator.

СЗМ NanoEducatorспеціально розроблено для проведення студентами лабораторних робіт. Цей прилад орієнтований на студентську аудиторію: він повністю управляється за допомогою комп'ютера, має простий та наочний інтерфейс, анімаційну підтримку, передбачає поетапне освоєння методик, відсутність складних налаштувань та недорогі витратні матеріали.

У цій лабораторній роботі Ви дізнаєтесь про скануючу зондову мікроскопію, познайомитеся з її основами, вивчіть конструкцію та принципи роботи навчального СЗМ NanoEducator, навчитеся готувати біологічні препарати для досліджень, отримайте своє перше СЗМ зображення комплексу бактерій кисломолочних і навчитеся основам обробки та подання результатів вимірювань.

7.2.Інформація для викладача 1

Лабораторна робота виконується у кілька етапів:

1. Підготовка зразка виконується кожним студентом індивідуально.

2. Отримання першого зображення виконується одному приладі під контролем викладача, далі кожен студент досліджує свій зразок самостійно.

3. Обробка експериментальних даних кожним студентом провадиться індивідуально.

Приклад для дослідження: кисломолочні бактерії на покривному склі.

До початку роботи необхідно підібрати зонд з найбільш характерною амплітудно-частотною характеристикою (одинаковий симетричний максимум), отримати зображення поверхні зразка, що досліджується.

Звіт з лабораторної роботи повинен включати:

1. теоретичну частину (відповіді на контрольні питання).

2. результати експериментальної частини (опис проведених досліджень, отримані результати та зроблені висновки).

1. Методи досліджень морфології біологічних об'єктів.

2. Скануючий зондовий мікроскоп:

конструкція СЗМ;

різновиди СЗМ: СТМ, АСМ;

формат СЗМ даних; візуалізація СЗМ даних.

3. Підготовка зразків для СЗМ досліджень:

морфологія та структура бактеріальних клітин;

приготування препаратів для вивчення морфології із застосуванням СЗМ.

4. Знайомство з конструкцією та програмою управління СЗМ NanoEducator.

5. Отримання СЗМ зображення.

6. Обробка та аналіз отриманих зображень. Кількісна характеризування СЗМ зображень.

Методи дослідження морфології біологічних об'єктів

Характерний діаметр клітин становить 1020 мкм, бактерій від 0.5 до 35 мкм, ці величини в 5 разів дрібніші найдрібнішої частки, видимий неозброєним оком. Тому перше вивчення клітин стало можливим лише після появи оптичних мікроскопів. Наприкінці XVII ст. Антоніо ван Левенгук виготовив перший оптичний мікроскоп, до цього люди не підозрювали про існування хвороботворних мікробів та бактерій [Літ. 7-1].

Оптична мікроскопія

Труднощі вивчення клітин пов'язані з тим, що вони безбарвні та прозорі, тому відкриття їх основних структур відбулося лише після введення у практику барвників. Барвники забезпечили достатню контрастність зображення. З допомогою оптичного мікроскопа можна розрізняти об'єкти, віддалені друг від друга на 0.2 мкм, тобто. Найменшими об'єктами, які ще можна розрізняти в оптичному мікроскопі є бактерії та мітохондрії. Зображення дрібніших елементів клітин спотворюються ефектами, викликаними хвильовою природою світла.

Для приготування препаратів, що довго зберігаються, клітини обробляють фіксуючим агентом для того, щоб іммобілізувати і зберегти їх. З іншого боку, фіксація підвищує доступність клітин барвникам, т.к. макромолекули клітин скріплюються поперечними зшивками, що стабілізує та закріплює їх у певному положенні. Найчастіше як фіксатори виступають альдегіди і спирти (наприклад, глутаральдегід або формальдегід формують ковалентні зв'язки з вільними аміногрупами білків і зшивають сусідні молекули). Після фіксації тканини зазвичай нарізують мікротом на дуже тонкі зрізи (товщиною від 1 до 10 мкм), які потім поміщають на предметне скло. При такому способі підготовки можна пошкодити структуру клітин або макромолекул, тому переважним методом є швидке заморожування. Заморожену тканину ріжуть мікротомом, встановленим у холодній камері. Після приготування зрізів клітини фарбують. В основному для цієї мети використовують органічні барвники (малахітову зелень, чорний судан і т.д.). Кожен з них характеризується певною спорідненістю до клітинних компонентів, наприклад, гематоксилін має спорідненість з негативно зарядженими молекулами, тому дозволяє виявити в клітинах ДНК. Якщо та чи інша молекула представлена ​​в клітині в незначній кількості, то найзручніше використовувати флуоресцентну мікроскопію.

Флуоресцентна мікроскопія

Флуоресціюючі барвники поглинають світло однієї довжини хвилі і випромінюють світло іншої, більшої довжини хвилі. Якщо таку речовину опромінити світлом, довжина хвилі якого збігається з довжиною хвилі світла, що поглинається барвником, і потім для аналізу використовувати фільтр, що пропускає світло з довжиною хвилі, що відповідає світлу, що випромінюється барвником, флуоресцентну молекулу можна виявити по світінню на темному полі. Висока інтенсивність світла, що випромінюється, є характерною особливістю таких молекул. Такий мікроскоп схожий на звичайний оптичний, але світло від потужного освітлювача проходить через два набори фільтрів - один для затримання частини випромінювання освітлювача перед зразком та інший для фільтрації світла, отриманого від зразка. Перший фільтр обраний таким чином, що він пропускає лише світло довжини хвилі, що збуджує певний флуоресцентний барвник; в той же час другий фільтр блокує це падаюче світло і пропускає світло довжини хвилі, що випромінюється барвником при його флуоресценції.

Флуоресцентна мікроскопія часто використовується для виявлення специфічних білків або інших молекул, які стають флуоресцентними після ковалентного зв'язування з флуоресцентними барвниками. Для цієї мети зазвичай використовують два барвники - флуоресцеїн,який дає інтенсивну жовто-зелену флуоресценцію після збудження світло-блакитним світлом, та родамін,що обумовлює темно-червону флуоресценцію після збудження жовто-зеленим світлом. Застосовуючи для фарбування і флюоресцин та родамін можна отримувати розподіл різних молекул.

Темнопільна мікроскопія

Найпростіший спосіб розглянути деталі клітинної структури – спостерігати світло, що розсіюється різними компонентами клітини. У темнопольному мікроскопелі від освітлювача направляються збоку і при цьому в об'єктив мікроскопа потрапляють тільки розсіяні промені. Відповідно клітина виглядає як освітлений об'єкт на темному полі. Однією з основних переваг темнопольної мікроскопії є можливість спостерігати рух клітин у процесі поділу та міграції. Клітинні рухи, як правило, відбуваються дуже повільно і їх складно спостерігати в реальному часі. У цьому випадку використовують покадрову (цейтраферну) мікрокінозйомку або відеозапис. Послідовні кадри при цьому розділені в часі, але при відтворенні з нормальною швидкістю картина реальних подій прискорюється.

У Останніми рокамивідеокамери та відповідні технології обробки зображення значно збільшили можливості оптичної мікроскопії. Завдяки їхньому застосуванню вдалося подолати труднощі, зумовлені особливостями фізіології людини. Вони полягають у тому, що:

1. Око у звичайних умовах не реєструє дуже слабке світло.

2. Око не здатне фіксувати невеликі відмінності в інтенсивності світла на яскравому тлі.

Перша з цих проблем була подолана після приєднання до мікроскопа надвисокочутливих відеокамер. Це дозволило спостерігати клітини протягом тривалого часу при низькій освітленості, виключаючи тривалий вплив яскравого світла. Системи обробки зображення особливо важливі вивчення у живих клітинах флуоресцирующих молекул. Оскільки зображення створюється відеокамерою у формі електронних сигналів, його можна відповідним чином перетворити на числові сигнали, направити в комп'ютер і потім піддати додаткової обробки для отримання прихованої інформації.

Високий контраст, досяжний за допомогою комп'ютерної інтерференційної мікроскопії, дозволяє спостерігати дуже дрібні об'єкти, як, наприклад, окремі мікротрубочки, діаметр яких менше однієї десятої довжини хвилі світла (0.025 мкм). Окремі мікротрубочки можна побачити за допомогою флуоресцентної мікроскопії. Однак в обох випадках неминучі ефекти дифракції, що сильно змінюють зображення. Діаметр мікротрубочок при цьому завищується (0.2 мкм), що не дозволяє відрізняти окремі мікротрубочки від пучка з декількох мікротрубочок. Для вирішення цього завдання необхідний електронний мікроскоп, межа роздільної здатності якого зсунута далеко за межі довжини хвилі видимого світла.

Електронна мікроскопія

Взаємозв'язок довжини хвилі та межі дозволу зберігається і для електронів. Однак для електронного мікроскопа межа дозволу істотно нижча за дифракційну межу. Довжина хвилі електрона зменшується із збільшенням його швидкості. В електронному мікроскопі з напругою 100000 довжина хвилі електрона дорівнює 0.004 нм. Відповідно до теорії, роздільна здатність такого мікроскопа в межі становить 0.002 нм. Однак у реальності внаслідок малої величини числових апертур електронних лінз дозвіл сучасних електронних мікроскопів у разі становить 0,1 нм. Труднощі приготування зразка, його пошкодження випромінюванням суттєво знижують нормальну роздільну здатність, яка для біологічних об'єктів становить 2 нм (приблизно в 100 разів вище, ніж у світлового мікроскопа).

Джерелом електронів у просвічує електронний мікроскоп (ПЕМ)є нитка катода, розташована у вершині циліндричної колони заввишки близько двох метрів. Щоб уникнути розсіювання електронів при зіткненнях із молекулами повітря, у колоні створюється вакуум. Електрони, що випромінюються катодною ниткою, прискорюються найближчим анодом і проникають через крихітний отвір, формуючи електронний промінь, що проходить у нижню частину колони. Уздовж колони на певній відстані розташовані кільцеві магніти, що фокусують електронний промінь, подібно до скляних лінз, фокусуючим промінь світла в оптичному мікроскопі. Зразок через повітряний шлюз поміщають усередину колони на шляху електронного пучка. Частина електронів у момент проходження через зразок розсіюється відповідно до щільності речовини в даній ділянці, залишок електронів фокусується і формує зображення (подібно до формування зображення в оптичному мікроскопі) на фотопластинці або на фосфоресційному екрані.

Одним з найбільших недоліків електронної мікроскопії є те, що біологічні зразки необхідно піддати спеціальній обробці. По-перше, їх фіксують спочатку глутаровим альдегідом, а потім осмієвою кислотою, що зв'язує та стабілізує подвійний шар ліпідів та білків. По-друге, електрони мають низьку проникаючу здатність, тому доводиться робити надтонкі зрізи, а для цього зразки зневоднюють і просочують смолами. По-третє, для посилення розмаїття зразки обробляють солями важких металів, такими як осмій, уран та свинець.

Для того, щоб отримати тривимірне зображення поверхні використовується скануючий електронний мікроскоп (СЕМ), де використовуються електрони, що розсіюються або випромінюються поверхнею зразка. Зразок у даному випадкуфіксують, висушують та покривають тонкою плівкою важкого металу, а потім сканують вузьким пучком електронів. При цьому оцінюється кількість електронів, що розсіюються при опроміненні поверхні. Отримане значення використовують для контролю інтенсивності другого променя, що рухається одночасно першому і формує зображення на екрані монітора. Дозвіл методу близько 10 нм і він не застосовується для вивчення внутрішньоклітинних органел. Товщина зразків, що вивчаються цим методом, визначається проникною здатністю електронів або їх енергією.

Основними та суттєвими недоліками всіх цих методів є тривалість, складність та висока вартістьприготування зразка.

Сканувальна зондова мікроскопія

У сканувальному зондовому мікроскопі (СЗМ) замість електронного променя або оптичного випромінювання використовується гострий зонд, голка, що сканує поверхню зразка. Образно висловлюючись, можна сказати, що й у оптичному чи електронному мікроскопах зразок оглядається, то СЗМ – обмацується. В результаті можна отримувати тривимірні зображення об'єктів у різних середовищах: вакуумі, повітрі, рідині.

Спеціальні конструкції СЗМ, адаптовані для біологічних досліджень, дозволяють одночасно з оптичним спостереженням сканувати живі клітини в різних рідких середовищах, так і фіксовані препарати на повітрі.

Скануючий зондовий мікроскоп

У назві скануючого зондового мікроскопа відображено принцип його дії - сканування поверхні зразка, при якому здійснюється зчитування поточного ступеня взаємодії зонда з поверхнею. Розмір області сканування та кількість точок у ній N X · N Y можна задавати. Чим більше задається точок, тим з більшою роздільною здатністю виходить зображення поверхні. Відстань між точками зчитування сигналу називається кроком сканування. Крок сканування повинен бути менше деталей поверхні, що вивчаються. Переміщення зонда в процесі сканування (див. мал. 7 -1) здійснюється лінійно у прямому та у зворотному напрямку (у напрямку швидкого сканування), перехід на наступну лінію здійснюється в перпендикулярному напрямку (у напрямку повільного сканування).

Мал. 7 1. Схематичне зображення процесу сканування
(зчитування сигналу здійснюється на прямому ході сканера)

Залежно від характеру зчитуваного сигналу, скануючі мікроскопи мають різні назви та призначення:

атомно-силовий мікроскоп (АСМ), зчитуються сили міжатомної взаємодії між атомами зонда та атомами зразка;

тунельний мікроскоп (СТМ), зчитується тунельний струм, що протікає між провідним зразком і зондом, що проводить;

магнітно-силовий мікроскоп (МФМ), зчитуються сили взаємодії між зондом, покритим магнітним матеріалом, і зразком, що виявляє магнітні властивості;

електростатичний силовий мікроскоп (ЕСМ) дозволяє одержувати картину розподілу електричного потенціалу поверхні зразка. Використовуються зонди, кінчик яких покритий тонкою плівкою (золото або платина).

Конструкція СЗМ

СЗМ складається з наступних основних компонентів (Рис 7 -2): зонда, п'єзоелектричних приводів для переміщення зонда X, Y, Z над поверхнею досліджуваного зразка, ланцюга зворотного зв'язку та комп'ютера для управління процесом сканування та отриманням зображення.

Рис 7 2. Схема скануючого зондового мікроскопа

Зондовий датчик - Компонент силового зондового мікроскопа, що здійснює сканування препарату. Зондовий датчик містить кантилевер (пружинну консоль) прямокутного (I-подібного) або трикутного (V-подібного) типів (Мал. 7 -3), на кінці якого розміщений гострий зонд (Мал. 7 -3), що має зазвичай конусну або пірамідальну форму . Іншим кінцем кантилевер стикується з підкладкою (з так званим чіпом). Зондові датчики виготовляються із кремнію або нітриду кремнію. Основною характеристикою кантилевера є силова константа (константа жорсткості), вона варіюється від 0.01 N/m до 1020 N/m. Для досліджень біологічних об'єктів використовуються “м'які” зонди із жорсткістю 0.01  0.06 N/m.

Мал. 7 3. Зображення пірамідальних АСМ зондових датчиків
отримане за допомогою електронного мікроскопа:
а – I-подібний тип, б – V-подібний тип, с – пірамідка на кінчику кантилевера

П'єзоелектричні приводи або сканери - для контрольованого переміщення зонда над зразком чи самого зразка щодо зонда на надмалих відстанях. У п'єзоелектричних приводах використовують п'єзокерамічні матеріали, які змінюють свої розміри при додатку до них електричної напруги. Процес зміни геометричних параметрів під впливом електричного поля називається зворотним пьезоэффектом. Найбільш поширений п'єзоматеріал – цирконат-титанат свинцю.

Сканер - конструкція з п'єзокераміки, що забезпечує переміщення за трьома координатами: x, y (у латеральній площині зразка) та z (по вертикалі). Існує кілька типів сканерів, найбільш поширеними з яких є трипідні та трубчасті (Рис. 7 -4).

Мал. 7 4. Конструкції сканерів: а) – трипідний; б) – трубчастий

У триподном сканері переміщення за трьома координатами забезпечують утворюють ортогональну структуру три незалежні п'єзокерамічні стрижні.

У трубчастому сканері порожниста п'єзоелектрична трубка згинається в площинах XZ і ZY і подовжується або стискається по осі Z при подачі відповідних напруг на електроди, що керують переміщеннями трубки. Електроди для управління рухом у площині XY розташовані на зовнішній поверхні трубки, для управління переміщенням Z на X і Y електроди подаються рівні напруги.

Ланцюг зворотного зв'язку - Сукупність елементів СЗМ, за допомогою якої при скануванні зонд утримується на фіксованій відстані від поверхні зразка (Рис. 7 -5). У процесі сканування зонд може перебувати на ділянках поверхні зразка з різним рельєфом, при цьому змінюватиметься відстань Z зонд-зразок, відповідно буде змінюватися і величина взаємодії зонд-зразок.

Мал. 7 5. Схема зворотного зв'язку скануючого зондового мікроскопа

При наближенні зонда до поверхні зростають сили взаємодії зонд-зразок, зростає сигнал реєструючого пристрою. V(t), Котрий виявляється у одиницях напруги. Компаратор порівнює сигнал V(t) з опорною напругою V опорнета виробляє коригуючий сигнал V корр. Сигнал корекції V коррподається на сканер і зонд відводиться від зразка. Опорна напруга – напруга, що відповідає сигналу реєструючого пристрою, коли зонд виявляється на заданій відстані від зразка. Підтримуючи в процесі сканування цю відстань зонд-зразок, система зворотного зв'язку підтримує задану силу взаємодії зонд-зразок.

Мал. 7 6. Траєкторія відносного руху зонда в процесі підтримки системою зворотного зв'язку постійної сили взаємодії зонд-зразок

Рис. 7 -6 показано траєкторію руху зонда щодо зразка при збереженні постійної сили взаємодії зонд-зразок. Якщо зонд виявляється над ямкою, на сканер подається напруга, коли сканер подовжується, опускаючи зонд.

Швидкість відгуку ланцюга зворотного зв'язку зміну відстані зонд-зразок (взаємодії зонд-зразок) визначається константою ланцюга зворотний зв'язок K. Значення Kзалежать від особливостей конструкції конкретного СЗМ (конструкції та характеристик сканера, електроніки), режиму роботи СЗМ (розміру області сканування, швидкості сканування тощо), а також особливостей поверхні, що досліджується (масштабу особливостей рельєфу, твердості матеріалу тощо).

Різновиди СЗМ

Скануючий тунельний мікроскоп

У СТМ реєструючим пристроєм (Мал. 7 -7) вимірюється тунельний струм, що протікає між металевим зондом, який змінюється в залежності від потенціалу на поверхні зразка та від рельєфу його поверхні. Зонд є гострою заточеною голкою, радіус закруглення вістря якої може досягати декількох нанометрів. Як матеріал для зонда зазвичай використовуються метали з високою твердістю та хімічною стійкістю: вольфрам або платина.

Мал. 7 7. Схема тунельного зондового датчика

Між зондом і провідним зразком прикладається напруга. Коли кінчик зонда виявляється з відривом близько 10А від зразка, електрони із зразка починають тунелювати через проміжок у зонд чи навпаки, залежно від знака напруги (Рис. 7 -8).

Мал. 7 8. Схематичне зображення взаємодії кінчика зонда із зразком

Тунельний струм, що виникає при цьому, вимірюється реєструючим пристроєм. Його величина I Тпропорційна доданій до тунельного контакту напруги Vта експоненційно залежить від відстані від голки до зразка d.

Таким чином, малим змінам відстані від кінчика зонда до зразка dвідповідають експоненційно великі зміни тунельного струму I Т(передбачається, що напруга Vпідтримується незмінним). Внаслідок цього чутливість тунельного зондового датчика достатня, щоб зареєструвати зміни висот менше 0,1 нм, і, отже, отримати зображення атомів на поверхні твердого тіла.

Атомно-силовий мікроскоп

Найбільш поширеним зондовим датчиком атомно-силової взаємодії є пружинний кантилевер (від англ. Cantilever - консоль) з розташованим на його кінці зондом. Розмір вигину кантилевера, що виникає внаслідок силової взаємодії між зразком і зондом (Рис 7 -9), вимірюється за допомогою оптичної схеми реєстрації.

Принцип дії силового датчика ґрунтується на використанні атомних сил, що діють між атомами зонда та атомами зразка. При зміні сили зонд-зразок змінюється величина вигину кантилевера, і така зміна вимірюється оптичної системиреєстрації. Таким чином, атомно-силовий датчик є гострий зонд з високою чутливістю, що дозволяє реєструвати сили взаємодії між окремим атомами.

При малих вигинах співвідношення між силою зонд-зразок Fі відхиленням кінчика кантилевери xвизначається законом Гука:

де k - Силова константа (константа жорсткості) кантилевера.

Наприклад, якщо використовується кантилевер з константою kпорядку 1 н/м, то під дією сили взаємодії зонд-зразок порядку 0.1 наноньютона величина відхилення кантилевера складе приблизно 0.1 нм.

Для вимірювання таких малих переміщень зазвичай використовується оптичний датчик зсувів (Рис 7 -9), що складається з напівпровідникового лазера і чотирисекційного фотодіода. При згинанні кантилевера відбитий від нього промінь лазера зміщується щодо центру фотодетектора. Таким чином, вигин кантилевера може бути визначений відносною зміною освітленості верхньої (T) і нижньої (B) половинок фотодетектора.

Рис 7 9. Схема силового датчика

Залежність сил взаємодії зонд-зразок від відстані зонд-зразок

При наближенні зонда до зразка він спочатку притягується до поверхні завдяки наявності сил, що притягають (сили Ван-дер-Ваальса). При подальшому наближенні зонда до зразка електронні оболонки атомів на кінці зонда та атомів на поверхні зразка починають перекриватися, що призводить до появи сили, що відштовхує. При подальшому зменшенні відстані сила, що відштовхує, стає домінуючою.

Загалом залежність сили міжатомної взаємодії Fвід відстані між атомами Rмає вигляд:

.

Константи aі bта показники ступеня mі nзалежать від сорту атомів та типу хімічних зв'язків. Для сил Ван-дер-Ваальса m=7 та n=3. Якісно залежність F(R) показано на Рис. 7-10.

Мал. 7 10. Залежність сили взаємодії між атомами від відстані

Формат СЗМ – даних, візуалізація СЗМ – даних

Дані про морфологію поверхні, отримані для дослідження на оптичному мікроскопі, подаються у вигляді збільшеного зображення ділянки поверхні. Інформація, що отримується за допомогою СЗМ, записується у вигляді двовимірного масиву цілих чисел A ij . Кожному значенню ij відповідає певна точка поверхні у межах поля сканування. Графічне відображення цього масиву чисел називається СЗМ сканованим зображенням.

Скановані зображення можуть бути двовимірними (2D), так і тривимірними (3D). При 2D візуалізації кожної точки поверхні Z= f(x,y) ставиться у відповідність певний колірний тон відповідно до висоти точки поверхні (Рис. 7 -11 а). При 3D візуалізації зображення поверхні Z= f(x,y) будується в аксонометрической перспективі з допомогою певним чином розрахованих пікселів чи ліній рельєфу. Найбільш ефективним способом розмальовки 3D зображень є моделювання умов підсвічування поверхні точковим джерелом, розташованим у певній точці простору над поверхнею (рис. 7-11 б). У цьому вдається підкреслити окремі малі особливості рельєфу.

Мал. 7 11. Лімфоцити крові людини:
а) 2D-зображення; б) 3D зображення з бічним підсвічуванням

Підготовка зразків для СЗМ дослідження

Морфологія та структура бактеріальних клітин

Бактерії – одноклітинні мікроорганізми, що мають різноманітну форму та складну структуру, що визначає різноманіття їх функціональної діяльності. Для бактерій характерні чотири основні форми: сферична (куляста), циліндрична (паличкоподібна), звивиста і ниткоподібна [Літ. 7-2].

Кокі (бактерії кулястої форми) – залежно від площини поділу та розташування окремих особин поділяються на мікрококи (окремо лежачі коки), диплококи (парні коки), стрептококи (ланцюжки коків), стафілококи (що мають вид виноградних грон), тетракоки (утворення) ) та сарцини (пакети з 8 або 16 коків).

Паличкоподібні – бактерії розташовуються у вигляді одиночних клітин, дипло-або стрептобактерій.

Покручені – вібріони, спірили та спірохети. Вібріони мають вигляд злегка вигнутих паличок, спірили – звивисту форму з кількома спіральними завитками.

Розміри бактерій коливаються від 0,1 до 10 мкм. До складу бактеріальної клітини входять капсула, клітинна стінка, цитоплазматична мембрана та цитоплазма. У цитоплазмі знаходяться нуклеотид, рибосоми та включення. Деякі бактерії забезпечені джгутиками та ворсинками. Ряд бактерій утворюють суперечки. Перевищуючи вихідний поперечний розмір клітини, суперечки надають їй веретеноподібної форми.

Для вивчення морфології бактерій на оптичному мікроскопі їх готують нативні (прижиттєві) препарати чи фіксовані мазки, пофарбовані аніліновим барвником. Існують спеціальні методи фарбування для виявлення джгутиків, клітинної стінки, нуклеотиду та різних цитоплазматичних включень.

Для СЗМ дослідження морфології бактеріальних клітин не потрібно забарвлення препарату. СЗМ дозволяє з високим ступенем дозволу визначити форму та розмір бактерій. При ретельному приготуванні препарату та використанні зонда з малим радіусом закруглення можливе виявлення джгутиків. У той же час через велику жорсткість клітинної стінки бактерій не можна «промацати» внутрішньоклітинні структури, як це можна зробити на деяких тваринних клітинах.

Приготування препаратів для СЗМ вивчення морфології

Для першого досвіду роботи із СЗМ рекомендується вибрати біологічний препарат, який не потребує складної підготовки. Цілком підійдуть легкодоступні та непатогенні кисломолочні бактерії з розсолу квашеної капусти або кисломолочних продуктів.

Для СЗМ дослідження на повітрі потрібно міцно зафіксувати об'єкт, що досліджується, на поверхні підкладки, наприклад, на покривному склі. Крім того, щільність бактерій у суспензії повинна бути такою, щоб клітини при осадженні на підкладку не злипалися, і відстань між ними була не надто велика, щоб при скануванні можна було в один кадр взяти кілька об'єктів. Ці умови виконуються, якщо правильно вибрати режим приготування зразка. Якщо нанести краплю розчину, що містить бактерії, на підкладку, то відбуватиметься їх поступове осадження та адгезія. Основними параметрами при цьому слід вважати концентрацію клітин у розчині та час осадження. Концентрацію бактерій у суспензії визначають за оптичним стандартом каламутності.

У разі роль гратиме лише одне параметр – час інкубації. Чим довше витримувати краплю на склі, тим більше виявиться щільність бактеріальних клітин. У той же час, якщо крапля рідини почне підсихати, то препарат буде занадто сильно забруднений компонентами розчину, що осадилися. Краплю розчину, що містить бактеріальні клітини (розсіл), наносять на покривне скло, витримують 5-60 хвилин (залежно від складу розчину). Потім, не чекаючи висихання краплі, ретельно промивають дистильованою водою (обмокуючи препарат пінцетом у склянку кілька разів). Після висушування препарат готовий для вимірювання СЗМ.

Для прикладу приготували препарати кисломолочних бактерій із розсолу квашеної капусти. Час витримування краплі розсолу на покривному склі вибрали 5 хв, 20 хв та 1 годину (крапля вже почала підсихати). СЗМ – кадри представлені на Мал. 7-12, Мал. 7 -13,
Мал. 7-14.

З малюнків видно, що з даного розчину оптимальний час інкубації 510 хв. Збільшення часу витримування краплі поверхні підкладки призводить до злипання бактеріальних клітин. У разі, коли крапля розчину починає підсихати, спостерігається осадження на скло компонентів розчину, які неможливо відмити.

Мал. 7 12. Зображення кисломолочних бактерій на покривному склі,
отримані за допомогою СЗМ.

Мал. 7 13. Зображення кисломолочних бактерій на покривному склі,
отримані за допомогою СЗМ. Час інкубації розчину 20 хв.

Мал. 7 14. Зображення кисломолочних бактерій на покривному склі,
отримані за допомогою СЗМ. Час інкубації розчину 1 год.

На одному з відібраних препаратів (Рис. 7 -12) ми постаралися розглянути, що ж є кисломолочними бактеріями, яка форма для них характерна в даному випадку. (Мал. 7 -15)

Мал. 7 15. АСМ – зображення кисломолочних бактерій на покривному склі.
Час інкубації розчину 5 хв.

Мал. 7 16. АСМ – зображення ланцюжка кисломолочних бактерій на покривному склі.
Час інкубації розчину 5 хв.

Для розсолу характерна форма бактерій паличкоподібної форми та розташування у вигляді ланцюжка.

Мал. 7 17. Вікно керуючої програми навчального СЗМ NanoEducator.
Панель інструментів

Використовуючи інструменти програми навчального СЗМ NanoEducator ми визначили розміри бактеріальних клітин. Вони склали приблизно від 0.5×1.6 мкм
до 0.8×3.5 мкм.

Отримані результати можна порівняти з даними, наведеними у визначнику бактерій Берджі [Літ. 7-3].

Кисломолочні бактерії відносяться до лактобактерій (Lactobacillus). Клітини мають вигляд паличок, зазвичай правильної форми. Палички довгі, іноді майже кокоподібні, зазвичай у коротких ланцюжках. Розміри 0,5 – 1,2 Х 1,0 – 10 мкм. Суперечка не утворюють; в поодиноких випадках рухливі за рахунок перитрихіальних джгутиків. Широко поширені у навколишньому середовищі, особливо часто зустрічаються у харчових продуктах тваринного та рослинного походження. Кисломолочні бактерії входять до нормальної мікрофлори травного тракту. Всім відомо, що квашена капуста, крім вмісту в ній вітамінів, корисна для покращення мікрофлори кишківника.

Конструкція скануючого зондового мікроскопа NanoEducator

Рис. 7 -18 представлений зовнішній вигляд вимірювальної головки СЗМ NanoEducatorта позначені основні елементи приладу, що використовуються під час роботи.

Мал. 7 18. Зовнішній виглядвимірювальної головки СЗМ NanoEducator
1- основа, 2-тримач зразка, 3- Датчик взаємодії, 4-гвинт фіксації датчика,
5-гвинт ручного підведення, 6-гвинти переміщення сканера із зразком у горизонтальній площині, 7-захисна кришка з відеокамерою

Рис. 7 -19 представлена ​​конструкція вимірювальної головки. На підставі 1 розташовані сканер 8 з тримачем зразка 7 механізм підведення зразка до зонда 2 на основі крокового двигуна. У навчальному СЗМ NanoEducatorзразок закріплюється на сканер і здійснюється сканування зразком щодо нерухомого зонда. Підведення зонда 6, закріпленого на датчику силової взаємодії 4, до зразка можна здійснювати за допомогою гвинта ручного підведення 3. Попередній вибір місця дослідження на зразку здійснюється за допомогою гвинта 9.

Мал. 7 19. Конструкція СЗМ NanoEducator: 1 – основа, 2 – механізм підведення,
3 – гвинт ручного підведення, 4 – датчик взаємодії, 5 – гвинт фіксації датчика, 6 – зонд,
7 – тримач зразка, 8 – сканер, 9, 10 – гвинти переміщення сканера із зразком

Навчальний СЗМ NanoEducatorскладається із з'єднаних кабелями вимірювальної головки, СЗМ контролера та керуючого комп'ютера. Мікроскоп має відеокамеру. Сигнал від датчика взаємодії після перетворення в підсилювачі надходить у СЗМ контролер. Управління роботою СЗМ NanoEducatorздійснюється від комп'ютера через СЗМ контролер.

Датчик силової взаємодії та зонд

У приладі NanoEducatorдатчик виконаний у вигляді п'єзокерамічної трубки завдовжки l=7 мм, діаметром d=1,2 мм та товщиною стінки h=0,25 мм, жорстко закріпленої з одного кінця. На внутрішню поверхню трубки нанесений провідний електрод. На зовнішню поверхню трубки нанесені два електрично ізольовані напівциліндричні електроди. До вільного кінця трубки прикріплено вольфрамовий дріт діаметром
100 мкм (Мал. 7 -20).

Мал. 7 20. Конструкція універсального датчика приладу NanoEducator

Вільний кінець дроту, що використовується як зонд, заточений електрохімічно, радіус закруглення має величину 0.2  0.05 мкм. Зонд має електричний контакт із внутрішнім електродом трубки, з'єднаним із заземленим корпусом приладу.

Наявність двох зовнішніх електродів на п'єзоелектричній трубці дозволяє як датчик силової взаємодії (датчика механічних коливань) використовувати одну частину п'єзоелектричної трубки (верхню, відповідно до Рис. 7 -21), а іншу частину використовувати як п'єзовібратор. До п'єзовібратора підводиться змінна електрична напруга з частотою, що дорівнює резонансній частоті силового датчика. Амплітуда коливань при великій відстані зонд-зразок максимальна. Як видно з Мал. 7 -22, в процесі коливань зонд відхиляється від рівноважного положення на величину А, рівну амплітуді його вимушених механічних коливань (вона становить частки мікрометра), при цьому на другій частині п'єзрубки (датчику коливань) виникає змінна електрична напруга, пропорційна зсуву зонда та вимірюється приладом.

При наближенні зонда до поверхні зразка зонд починає торкатися зразка у процесі коливань. Це призводить до усунення амплітудно-частотної характеристики (АЧХ) коливань датчика вліво порівняно з АЧХ, виміряної далеко від поверхні (Рис. 7 -22). Так як частота коливань, що змушують, п'єзрубки підтримується постійною і рівною частоті коливань  про у вільному стані, то при наближенні зонда до поверхні амплітуда його коливань зменшується і стає рівною A. Ця амплітуда коливань реєструється з другої частини п'єзрубки.

Мал. 7 21. Принцип роботи п'єзоелектричної трубки
як датчик силової взаємодії

Мал. 7 22. Зміна частоти коливань силового датчика
при наближенні до поверхні зразка

Сканер

Спосіб організації мікропереміщень, що використовується у приладі NanoEducator, заснований на використанні затиснутої по периметру металевої мембрани, до поверхні якої приклеєна п'єзопластинка (Мал. 7 -23 а). Зміна розмірів п'єзопластинки під дією напруги, що управляє, буде призводити до вигину мембрани. Розташувавши такі мембрани по трьох перпендикулярних сторонах куба і з'єднавши їх центри металевими штовхачами, можна отримати 3 х -координатний сканер (Рис. 7 -23 б).

Мал. 7 23. Принцип дії (а) та конструкція (б) сканера приладу NanoEducator

Кожен п'єзоелемент 1, закріплений на гранях куба 2, при додатку до нього електричної напруги може пересувати прикріплений до нього штовхач 3 в одному з трьох взаємно перпендикулярних напрямків - X, Y або Z. Як видно з малюнка, всі три штовхачі з'єднані в одній точці 4 .З деяким наближенням можна вважати, що ця точка переміщається за трьома координатами X, Y, Z . До цієї точки прикріплюється стійка 5 з тримачем зразка 6. Таким чином, зразок переміщається по трьох координат під дією трьох незалежних джерел напруги. У приладах NanoEducatorмаксимальне переміщення зразка становить близько 5070 мкм, що і визначає максимальну площу сканування.

Механізм автоматизованого підведення зонда до зразка (захоплення зворотного зв'язку)

Діапазон переміщень сканера осі Z становить близько 10 мкм, тому перед початком сканування необхідно наблизити зонд до зразка на цю відстань. Для цього призначений механізм підведення, схема якого наведена на Рис. 7-19. Кроковий двигун 1 при подачі на нього електричних імпульсів обертає гвинт подачі 2 і переміщає планку 3 з зондом 4, наближаючи або віддаляючи від зразка 5, встановленого на сканері 6. Величина одного кроку становить близько 2 мкм.

Мал. 7 24. Схема механізму підведення зонда до поверхні зразка

Оскільки крок механізму підведення значно перевищує величину необхідної відстані зонд-зразок у процесі сканування, те щоб уникнути деформації зонда його підведення здійснюється за одночасної роботі крокового двигуна і переміщенням сканера по осі Z за наступним алгоритмом:

1. Система зворотного зв'язку відключається і сканер "втягується", тобто опускає зразок у нижнє крайнє положення.

2. Механізм підведення зонда робить один крок і зупиняється.

3. Система зворотного зв'язку включається, і сканер плавно піднімає зразок, одночасно проводиться аналіз взаємодії зонд-зразок.

4. Якщо відсутня взаємодія, процес повторюється з пункту 1.

Якщо під час витягування сканера вгору з'явиться ненульовий сигнал, система зворотного зв'язку зупинить рух сканера вгору та зафіксує величину взаємодії на заданому рівні. Величина силової взаємодії, при якій відбудеться зупинка підведення зонда і відбуватиметься процес сканування, у приладі NanoEducatorхарактеризується параметром Придушення амплітуди (AmplitudeSuppression) :

A = A o . (1- Amplitude Suppression)

Отримання СЗМ-зображення

Після виклику програми NanoEducatorна екрані комп'ютера з'являється головне вікно програми (Мал. 7-20). Роботу слід розпочати з пункту меню Файлі в ньому вибрати Відкритиабо новийабо відповідні кнопки на панелі інструментів (, ).

Вибір команди Файл новийозначає перехід до проведення СЗМ вимірів, а вибір команди Файл Відкритиозначає перехід до перегляду та обробки раніше отриманих даних. Програма дозволяє здійснювати перегляд та обробку даних паралельно з вимірами.

Мал. 7 25. Головне вікно програми NanoEducator

Після виконання команди Файл новийна екрані з'являється діалогове вікно, яке дозволяє вибрати або створити робочу папку, в який за замовчуванням будуть записуватися результати поточного вимірювання. У процесі проведення вимірювань усі отримані дані послідовно записуються у файли з іменами ScanData+i.spm, де індекс iобнулюється при запуску програми та нарощується при кожному новому вимірі. Файли ScanData+i.spmпоміщаються у робочу папку, що встановлюється перед початком вимірів. Існує можливість вибору іншої робочої папкипід час проведення вимірів. Для цього потрібно натиснути кнопку , розташовану на панелі інструментів головного вікна програми та вибрати пункт меню Змінити робочу папку.

Для збереження результатів поточного виміру необхідно натиснути кнопку Зберегти яку вікні сканування у вікні діалогу вибрати папку і вказати ім'я файлу, при цьому файл ScanData+i.spm, який служить тимчасовим файлом збереження даних у процесі проведення вимірювань, буде перейменовано на вказане ім'я файлу. За промовчанням файл буде збережено у робочій папці, призначеній перед початком вимірювань. Якщо не виконати операцію збереження результатів вимірювань, то під час наступного запуску програми результати, записані у тимчасових файлах ScanData+i.spm, будуть послідовно перезаписуватись (якщо не змінено робочу папку). Про наявність тимчасових файлів результатів вимірювань у робочій папці видається попередження перед закриттям та після запуску програми. Зміна робочої папки перед проведенням вимірювань дозволяє захистити результати попереднього експерименту від видалення. Стандартне ім'я ScanDataможна змінити, задавши його у вікні вибору робочої папки. Виклик вікна вибору папки відбувається при натисканні кнопки , розташована на панелі інструментів головного вікна програми. Зберегти результати вимірювань можна також у вікні Браузер сканів, по черзі виділяючи необхідні файлита зберігаючи їх у вибраній папці.

Існує можливість експорту результатів, отриманих за допомогою приладу NanoEducator в формат ASCII і формат Nova (фірма НТМДТ), який може бути імпортований програмою НТ МДТ Nova, Image Analysis та іншими програмами. У формат ASCII експортуються зображення сканів, дані їх перерізів, результати вимірювання спектроскопії. Для експорту даних потрібно натиснути кнопку Експорт, розташовану в інструментальній панелі головного вікна програми, або вибрати Експорту пункті меню Файлцього вікна та вибрати відповідний формат експорту. Дані для обробки та аналізу можна відразу надіслати в попередньо запущену програму Image Analysis.

Після закриття вікна діалогу на екран виводиться панель керування приладом
(Мал. 7 -26).

Мал. 7 26. Панель керування приладом

У лівій частині панелі керування приладом розташовані кнопки вибору конфігурації СЗМ:

ССМ- Скануючий силовий мікроскоп (ССМ)

СТМ- Скануючий тунельний мікроскоп (СТМ).

Проведення вимірів на навчальному СЗМ NanoEducator полягає у виконанні наступних операцій:

1. Встановлення зразка

УВАГА! Перед встановленням зразка необхідно зняти датчик із зондом, щоб не пошкодити зонд.

Передбачено два способи кріплення зразка:

на магнітному столику (у цьому випадку зразок має бути прикріплений до магнітної підкладки);

на двосторонній липкій стрічці.

УВАГА! Для встановлення зразка на двосторонній липкій стрічці, необхідно викрутити тримач зі стійки (щоб не пошкодити сканер), а потім знову вкрутити його до легкого упору.

У разі магнітного кріплення заміна зразка може виконуватися без відгвинчування утримувача зразка.

2. Встановлення зондового датчика

УВАГА! Встановлювати датчик із зондом слід завжди після встановлення зразка.

Вибравши потрібний зондовий датчик (тримайте датчик за металеві кромки основи) (див. Мал. 7 -27), послабте гвинт фіксації зондового датчика 2 на кришці вимірювальної головки, вставте датчик у гніздо тримача до упору, закрутіть гвинт фіксації за годинниковою стрілкою до легкого .

Мал. 7 27. Встановлення зондового датчика

3. Вибір місця сканування

При виборі на зразку ділянки дослідження використовуйте гвинти переміщення двокоординатного столика, розташованого в нижній частині приладу.

4. Попереднє підведення зонда до зразка

Операція попереднього підведення не є обов'язковою для кожного виміру, необхідність її виконання залежить від величини відстані між зразком і вістрям зонда. Операцію попереднього зближення бажано проводити, якщо відстань між кінчиком зонда та поверхнею зразка перевищує 0.51 мм. При використанні автоматизованого підведення зонда до зразка з великої відстані між ними процес підведення займе багато часу.

Скористайтеся гвинтом ручного підведення для опускання зонда, контролюючи відстань між ним та поверхнею зразка візуально.

5. Побудова резонансної кривої та встановлення робочої частоти

Ця операція обов'язково виконується на початку кожного виміру і, доки вона не зроблена, перехід до подальших етапів вимірів заблокований. Крім того, у процесі вимірювань іноді виникають ситуації, що вимагають повторного виконання цієї операції (наприклад, у разі втрати контакту).

Вікно пошуку резонансу викликається натисканням кнопки на панелі керування приладом. Виконання цієї операції передбачає вимірювання амплітуди коливань зонда при зміні частоти вимушених коливань, що задаються генератором. Для цього потрібно натиснути кнопку RUN(Мал. 7 -28).

Мал. 7 28. Вікно операції пошуку резонансу та встановлення робочої частоти:
а) – автоматичний режим; б) – ручний режим.

В режимі Автоавтоматично встановлюється частота генератора, що дорівнює частоті, при якій спостерігалася максимальна амплітуда коливань зонда. Графік, що демонструє зміну амплітуди коливань зонда в заданому діапазоні частот (Рис. 7 -28а), дозволяє спостерігати форму резонансного піку. Якщо резонансний пік недостатньо яскраво виражений, або амплітуда при частоті резонансу мала ( менше 1В), то необхідно змінити параметри проведення вимірювань та повторно провести визначення резонансної частоти.

Для цього призначено режим Ручний. При виборі цього режиму у вікні Визначення резонансної частотиз'являється додаткова панель
(Мал. 7 -28б), що дозволяє коригувати такі параметри:

Напруга розгойдування зонда, що задаються генератором. Рекомендується встановлювати цю величину мінімальної (аж до нуля) та не більше 50 мВ.

Коефіцієнт посилення амплітуди ( Посилення амплітуди). При недостатній величині амплітуди коливань зонда (<1 В) рекомендуется увеличить коэффициент Посилення амплітуди.

Для початку операції пошуку резонансу необхідно натиснути кнопку Старт.

Режим Ручнийдозволяє вручну змінювати вибрану частоту, пересуваючи зелений курсор на графіку за допомогою миші, а також уточнити характер зміни амплітуди коливань у вузькому діапазоні значень навколо вибраної частоти (для цього необхідно встановити перемикач Ручний режиму становище Точнота натиснути кнопку Старт).

6. Захоплення взаємодії

Для захоплення взаємодії виконується процедура контрольованого зближення зонда та зразка за допомогою механізму автоматизованого підведення. Вікно керування цією процедурою викликається натисканням кнопки на панелі керування приладом. Під час роботи з ССМ ця кнопка стає доступною після виконання операції пошуку та встановлення резонансної частоти. Вікно ССМ, Підведення(Мал. 7 -29) містить елементи керування підведенням зонда, а також індикації параметрів, які дозволяють аналізувати процес виконання процедури.

Мал. 7 29. Вікно процедури підведення зонда

У вікні Підведеннякористувач має можливість спостерігати за такими величинами:

подовженням сканера ( СканерZ) по осі Z щодо максимально можливої, прийнятої за одиницю. Величина відносного подовження сканера характеризується рівнем заповнення лівого індикатора кольором, що відповідає зоні, в якій знаходиться сканер в даний момент: зелений колір – робоча зона, синій – поза робочою зоною, червоний – сканер підійшов надто близько до поверхні зразка, що може спричинити деформацію зонда. У разі програма видає звукове попередження;

амплітудою коливань зондащодо амплітуди його коливань без силової взаємодії, прийнятої за одиницю. Величина відносної амплітуди коливань зонда показана правому індикаторі рівнем його заповнення бордовим кольором. Горизонтальна мітка на індикаторі Амплітудою коливань зондавказує на рівень, при переході через який проводиться аналіз стану сканера та його автоматичне виведення в робоче положення;

кількість кроків ( Шагі), пройдених у заданому напрямку: Підведення – зближення, Відведення – видалення.

До початку процесу опускання зонда необхідно:

Перевірити правильність установок параметрів зближення:

Коефіцієнт посилення ланцюга зворотний зв'язок Посилення ОСвстановлений на значенні 3 ,

Переконайтеся, що параметр Придушенняамплітуди (Сила)має величину близько 0,2 (див. мал. 7 -29). В іншому випадку натиснути кнопку Силаі у вікні Встановлення параметрів взаємодії (Рис. 7-30)встановити значення Придушенняамплітудирівне 0.2. Для більш делікатного підведення значення параметра Придушенняамплітудиможе бути менше .

Перевірити правильність установок у вікні параметрів Параметри, сторінка Параметри підведення.

Є взаємодія чи ні, можна визначити за лівим індикатором СканерZ. Повне подовження сканера (весь індикатор СканерZпофарбований синім кольором), а також повністю зафарбований бордовим кольором індикатор Амплітуда коливань зонда(Мал. 7 -29) вказують на відсутність взаємодії. Після виконання пошуку резонансу та встановлення робочої частоти амплітуда вільних коливань зонда приймається за одиницю.

Якщо ж сканер подовжено не повністю або під час зближення, або програма видає повідомлення: 'Помилка! Зонд дуже близький до зразка. Перевірте параметри підведення чи фізичний вузол. Ви хочете відійти в безпечне місце", то рекомендується призупинити виконання процедури підведення та:

a. змінити один із параметрів:

збільшити величину взаємодії, параметр Придушенняамплітуди, або

збільшити значення Посилення ОС, або

збільшити час затримки між кроками зближення (параметр Час інтегруванняна сторінці Параметри підведеннявікна Параметри).

b. збільшити відстань між вістрям зонда та зразком (для цього виконати дії, описані в пункті та виконати операцію Резонанс, після чого повернутися до виконання процедури Підведення.

Мал. 7 30. Вікно встановлення величини взаємодії зонда та зразка

Після захоплення взаємодії з'являється повідомлення “ Підведення виконане”.

При необхідності здійснити зближення на один крок слід натиснути кнопку . У цьому випадку спочатку виконується крок, а потім здійснюється перевірка критеріїв захоплення взаємодії. Для зупинки руху необхідно натиснути кнопку . Для виконання операції відведення необхідно натиснути кнопку для швидкого відведення

або натиснути кнопку для повільного відведення. При необхідності здійснити відведення на один крок слід натиснути кнопку . У цьому випадку спочатку виконується крок, а потім здійснюється перевірка критеріїв захоплення взаємодії

7. Сканування

Після виконання процедури підведення ( Підведення) та захоплення взаємодії стає доступним сканування (кнопка у вікні панелі керування приладом).

Натиснувши цю кнопку (вигляд вікна сканування представлений на Рис. 7 -31), користувач приступає безпосередньо до проведення вимірювань та отримання результатів вимірювань.

Перед скануванням необхідно встановити параметри сканування. Ці параметри згруповані у правій частині верхньої панелі вікна Сканування.

Вперше після запуску програми вони встановлюються за замовчуванням:

Площа сканування - Область (Xнм*Yнм): 5000*5000 нм;

Кількість точоквимірювань по осях- X, Y: NX=100, NY=100;

Шлях сканування - Напрямвизначає напрямок сканування. Програма дозволяє вибирати напрямок осі швидкого сканування (Х або Y). Під час запуску програми встановлюється Напрям

Після встановлення параметрів сканування необхідно натиснути кнопку Застосуватидля підтвердження введення параметрів та кнопки Стартдля початку сканування.

Мал. 7 31. Вікно управління процесом та відображення результатів сканування ССМ

7.4.Методичні вказівки

Перш ніж розпочати роботу на сканувальному зондовому мікроскопі NanoEducator слід вивчити посібник користувача приладу [Лит. 7-4].

7.5.Техніка безпеки

Для живлення приладу використовується напруга 220 В. Експлуатацію скануючого зондового мікроскопа NanoEducator проводити відповідно до ПТЕ та ПТБ електроустановок споживачів напругою до 1000 В.

7.6.Завдання

1. Підготуйте самостійно біологічні зразки для досліджень методом СЗМ.

2. Вивчіть практично загальну конструкцію приладу NanoEducator.

3. Ознайомтеся з програмою керування приладом NanoEducator.

4. Отримайте перше СЗМ зображення під контролем викладача.

5. Проведіть обробку та аналіз отриманого зображення. Які форми бактерій притаманні вашому розчину? Чим визначається форма та розміри бактеріальних клітин?

6. Візьміть Визначник бактерій Берджі та порівняйте отримані результати з описаними там.

7.7.Контрольні питання

1. Які методи дослідження біологічних об'єктів?

2. Що таке скануюча зондова мікроскопія? Який принцип лежить у її основі?

3. Назвіть основні компоненти СЗМ та їх призначення.

4. Що таке п'єзоелектричний ефект і як він застосовується у СЗМ. Опишіть різні конструкції сканерів.

5. Опишіть загальну конструкцію приладу NanoEducator.

6. Опишіть датчик силової взаємодії та принцип його дії.

7. Опишіть механізм підведення зонда до зразка у приладі NanoEducator. Поясніть параметри, що визначають силу взаємодії зонда із зразком.

8. Поясніть принцип сканування та роботи системи зворотного зв'язку. Розкажіть про критерії вибору параметрів сканування.

7.8.Література

Літ. 7 1. Поль де Крюї. Мисливці за бактеріями. М. Терра. 2001.

Літ. 7 2. Посібник до практичних занять з мікробіології. За ред Єгорова Н.С. М: Наука, 1995.

Літ. 7 3. Хоулт Дж., Кріг Н., П. Сніт, Дж. Стейлі, С. Вільямс. // Визначник бактерій Берджі. М.: Світ, 1997. Т. № 2. C. 574.

Літ. 7 4. Посібник користувача приладу NanoEducator.об'єктів. Нижній Новгород. Науково-освітній центр...